辣椒轻斑驳病毒的检测及其与烟草花叶病毒症状差异相关因子研究

论文摘要

为了防止北京近郊甜椒上新出现病害-辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）病害的蔓延和危害,本研究开发了一种地高辛标记的cDNA探针利用核酸斑点杂交技术对PMMoV进行检测研究。通过对探针特异性和灵敏度的测试,证明了该探针能够特异检测PMMoV,稀释限点对应的植物组织材料为0.8μg,与RT-PCR及DAS-ELISA两种方法比较,比DAS-ELISA方法灵敏（39.06μg）,没有RT-PCR灵敏（0.008μg）。但是综合考虑地高辛标记的cDNA探针是大量田间样品常规检测较好的方法。采取北京郊区和河北保定地区的类似PMMoV症状的93种田间样品和18种商品种子样品进行了检测,将检测结果用更加灵敏的RT-PCR方法进行了验证,两种方法结果基本一致,表明了地高辛标记的cDNA探针在实际应用中检测结果可靠。通过对田间样品的检测,初步揭示了2006年北京附近地区PMMoV病害发生情况,对病害的防治有重要的指导意义。地高辛标记探针的开发为今后PMMoV田间样品的常规检测提供了方便,快捷,灵敏,安全的检测方法,为PMMoV病害的防治奠定了基础。利用分步构建策略构建了含有PMMoV-CN全长基因组序列的侵染性cDNA克隆pMQC。构建过程中在PMMoV-CN基因组序列的5’端引入了T7启动子和提高转录效率的两个G,3’端引入单一酶切位点SmaI,采用pMD18-T simple载体作为基础载体,将PMMoV-CN全基因组序列分为三段逐步构建到pMD18-T simple载体上,得到含有病毒全长基因组序列的重组载体之后,利用SmaI酶切位点将载体线性化,以线性化载体为模板进行体外转录。将体外转录产物接种矮牵牛,苋色藜和昆诺藜,通过症状观察以及分子生物学方法（包括RT-PCR,Western blot和地高辛标记的cDNA探针）验证了pMQC的侵染性。成功构建PMMoV-CN的侵染性cDNA克隆,为今后PMMoV基因组功能及致病机制的研究奠定了基础。将侵染性克隆pMQC的CP置换为TMV-U1和ToMV-S1的CP得到了两个杂合侵染性克隆pM-T-CP和pM-To-CP,将两个杂合侵染性克隆体外转录产物接种矮牵牛和苋色藜观察症状,以TMV-U1（ToMV-S1）和PMMoV-CN为参照,结果采用分子生物学方法（RT-PCR,核酸斑点杂交和Western blot）进行验证。最终结果为:在矮牵牛上,pM-To-CP没有侵染性;PMMoV-CN CP置换为TMV CP之后使PMMoV-CN由局部侵染变为系统侵染,说明TMV CP可能在pM-T-CP系统侵染矮牵牛中起主要作用,CP可能作为主要因子协助该病毒在矮牵牛中进行长距离运动,TMV-U1和PMMoV-CN CP之间的差异是导致两种病毒在矮牵牛上症状差异的决定因子。在苋色藜上,pM-To-CP依然没有侵染性;PMMoV-CN CP置换为TMV CP并没有改变PMMoV-CN在苋色藜上的斑驳症状,说明PMMoV-CN CP可能在PMMoV-CN侵染苋色藜产生斑驳症状过程中没有起到重要作用,或者PMMoV-CN CP在苋色藜上产生斑驳症状的作用被TMV-U1 CP弥补了,而且说明了TMV-U1在苋色藜上产生局部枯斑症状所需要的TMV中的无毒基因可能不是它的CP。TMV-U1 CP与PMMoV-CN CP之间的差异不是两种病毒在苋色藜上症状差异的决定因子。为了进一步确定PMMoV-CN CP序列中的哪一部分序列与TMV-U1序列的差异导致它们在矮牵牛上症状为局部侵染和系统侵染的差异,本研究构建了两个杂合侵染性克隆,pM-T-CP1、pM-T-CP2,它们分别对应着PMMoV-CN CP的1-117、1-237位核苷酸序列置换为TMV-U1 CP对应序列。体外转录之后接种矮牵牛植株,观察症状及通过分子生物学方法验证,证明了两种杂合病毒对矮牵牛为局部侵染。说明PMMoV-CN CP的1-117和1-237位的核苷酸与TMV-U1对应序列的差异并没有导致两种病毒在矮牵牛上的症状差异。为了进一步确定TMV-U1CP序列中哪一部分序列在症状改变中起主要作用,今后的研究将对PMMoV CP其它部分的序列进行置换以及采用定点突变等方法来揭示两种病毒症状差异的原因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 辣椒轻斑驳病毒的研究现状
• 1.1.1 辣椒轻斑驳病毒病害的发生情况
• 1.1.2 辣椒轻斑驳病毒病原的分类情况
• 1.1.3 辣椒轻斑驳病毒基因组结构及部分序列与致病性关系的研究进展
• 1.2 烟草花叶病毒属研究进展
• 1.2.1 病毒的基因组结构
• 1.2.2 病毒的侵染循环
• 1.2.3 基因组各组分功能研究进展
• 1.2.4 植物病毒的长距离运动
• 1.3 病毒检测技术研究进展
• 1.3.1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法
• 1.3.2 以病毒核酸为基础的检测方法
• 1.4 侵染性CDNA 克隆的构建研究进展
• 1.5 本研究的立论依据和研究意义
• 第二章 利用地高辛标记的核酸斑点杂交方法对辣椒轻斑驳病毒的检测
• 2.1 地高辛标记的探针的制备
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.2 结果与分析
• 2.2 RT-PCR，DAS-ELISA 和地高辛斑点杂交三种方法对PMMOV 检测灵敏度的比较
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.2 结果与分析
• 2.3 DIG 斑点杂交方法对田间PMMOV 样品的检测
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.2 结果与分析
• 2.4 结论与讨论
• 第三章 辣椒轻斑驳病毒中国分离物侵染性克隆载体构建及侵染性验证
• 3.1 T7 启动子控制下的PMMOV-CN 全长克隆的构建
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.2 结果与分析
• 3.2 侵染性克隆体外转录及侵染性验证
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 结果与分析
• 3.3 结论与讨论
• 第四章 辣椒轻斑驳病毒，烟草花叶病毒，番茄花叶病毒症状差异分子机理研究
• 4.1 CP 对PMMOV-CN 与TMV 和TOMV 在寄主植物上致病差异的作用
• 4.1.1 材料与方法
• 4.1.2 结果与分析
• 4.2 CP 部分序列对PMMOV-CN 和TMV-U1 在矮牵牛上症状差异的作用
• 4.2.1 材料与方法
• 4.2.2 结果与分析
• 4.3 结论与讨论
• 4.3.1 选择PMMoV，TMV 和ToMV 进行研究的原因分析及杂合侵染性克隆构建结果讨论
• 4.3.2 选择CP 作为置换基因的原因及长距离运动机制研究进展
• 4.3.3 Tobamovirus 病毒CP 参与长距离运动的研究进展及CP 在pM-T-CP侵染矮牵牛过程中作用机制的讨论
• 4.3.4 pM-T-CP 在苋色藜上侵染产生局部斑驳症状机制分析
• 4.3.5 pM-To-CP 没有侵染性的原因分析
• 第五章 全文结论
• 5.1 PMMOV 检测DIG 标记的核酸斑点杂交探针的开发结果
• 5.2 PMMOV-CN 侵染性克隆的构建及侵染性验证结果
• 5.3 TMV-U1 （TOMV-51） CP 置换PMMOV-CN CP 的杂合侵染性克隆PM-T（TO）-CP 的构建及致病差异研究结果
• 5.4 TMV-U1 CP 与PMMOV-CN CP 部分序列置换的杂合侵染性克隆构建及症状差异研究结果
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 致谢
• 作者简介