论文摘要
前言:组织和器官移植是20世纪最重要的医学成就之一。作为公认的终末期器官功能衰竭最有效的治疗手段,器官移植的成功主要取决于组织配型的进步、精湛的外科技术、新型免疫抑制药物的应用以及良好的抗感染处理。然而有些关键问题仍困扰着移植工作,急、慢性排斥反应导致移植器官功能丧失、长期服用免疫抑制剂增加了感染与恶性疾病的发生率等依然是临床移植工作面临的重要挑战。目前国际上公认的诊断急性排斥反应（Acute Rejection,AR）的“金标准”仍然是移植物局部组织病理学活检,但由于其对移植器官创伤大、花费高以及医师操作复杂、取样误差和连续检测困难等原因致使大多数病人不太愿意接受;而临床正在应用的多种无创性诊断方法,如生化学检测（C反应蛋白,CRP）、血液学检查（CD4/CD8比值、可溶性HLA、CD30、细胞因子、趋化因子等）、影像学检查、针对肾移植的尿液检查等等,其准确性、敏感性、特异性等方面的不足也使其在临床上的应用差强人意。由于目前尚缺乏有效、成熟的移植排异反应的早期监测指标,临床只有到脏器发生了实质性损害,功能检查异常时,才发现排异反应,导致治疗滞后,抢救成功率降低,所以,寻找一个早期的、快速的、无创的、特异性和敏感性都非常优越的监测指标能早期诊断AR是移植领域亟待解决的重大课题。众所周知,主要组织相容性复合体（MHC,人类的MHC分子为HLA抗原）是启动移植排斥反应的靶抗原,是移植免疫的主角。MHC分子具有高度的多态性,MHC-Ⅰ基因外显子2、3呈多态性,在移植配型时,决定供、受体是否匹配;外显子4编码的胞外区域和外显子5编码的重链跨膜区属于非多态区,不受多态性影响,能进行个体间定量比较。MHC-Ⅰ类抗原表达于所有有核细胞表面,尤以外周血淋巴细胞（PBLs）表达最多。淋巴细胞是机体对异种抗原发生免疫反应的主要细胞,其功能状态与其表面众多复杂的膜蛋白有关;淋巴细胞表面表达丰富的MHC-Ⅰ,却一直未引起研究者的重视。Le morvan研究发现宿主外周血淋巴细胞HLA-Ⅰ转录水平的表达随年龄增加而降低,使得机体容易诱发感染和肿瘤,认为淋巴细胞HLA-Ⅰ的表达可作为评价机体免疫功能衰退的指标;Hoffmann等研究证实淋巴细胞表面MHC-Ⅰ分子的表达与其活性及凋亡有关;我们前期曾采用siRNA技术干扰淋巴细胞MHC-Ⅰ基因的表达后发现淋巴细胞的增殖和杀伤活性均明显下降。由此可见,淋巴细胞MHC-Ⅰ分子的表达与机体的免疫功能有关。那么,让我们感兴趣的是:当移植排斥反应发生时,1)移植受者PBLs MHC-Ⅰ有何变化,变化是否有规律性,能否预测移植排斥反应的发生?2)PBLs MHC-Ⅰ表达的变化与全身MHC-Ⅰ表达之间有何关系,能否作为宿主免疫功能的代表? 3)MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ哪个基因位点更适合于移植排斥反应的监测?4)MHC-Ⅰ转录水平和蛋白表达水平之间的关系如何,哪个更适合于移植排斥反应的监测? 5)免疫抑制剂对PBLs MHC-Ⅰ的表达有何影响?这一系列问题值得多角度、系统全面的动物实验加以研究。目前国内外文献对于AR发生时PBLs MHC-Ⅰ蛋白水平一过性升高已有报道,但对MHC-Ⅰ基因转录水平表达变化的研究尚未见报道。在MHC研究中,小鼠由于具有繁殖快、易于饲养并培育出了各种近交系、同类系、重组系,成为MHC研究中最重要的动物模型。本实验采用近交系小鼠进行大样本的动物实验是因为小鼠的MHC复合体（H-2系统）与人类的HLA系统具有极大的同源性,所以研究小鼠的H-2系统在移植排斥反应中的变化规律也能间接反映人类HLA系统的变化特点。本研究着眼于移植受者宿主免疫系统,采用经典的皮肤移植排斥模型,通过连续检测近交系小鼠同种异基因皮肤移植手术前后、排斥反应发生前后外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ类基因和蛋白水平的表达变化及其与免疫抑制剂应用剂量之间的关系,揭示移植排斥反应发生过程中,受者外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ类分子的动态变化规律;并从急性排斥标记物入手,探索PBLs MHC-ⅠmRNA的表达能否成为AR的诊断标记物,拟发现一种敏感的早期诊断急性移植排斥反应的无创性指标,监测急性移植排斥反应的发生,并为临床免疫抑制剂的个体化用药提供实验依据,从而提高移植手术的成功率。目的:1.建立检测移植受者外周血淋巴细胞（PBLs）主要组织相容性复合体（MHC）mRNA表达的实时荧光定量聚合酶链反应（Real Time PCR）的方法。2.通过动态连续检测宿主PBLs MHC-Ⅰ基因和蛋白水平的表达,揭示移植受者PBLs MHC-Ⅰ在急性移植排斥反应过程中的变化规律,探讨其表达与同种异体移植急性排斥反应发生进程的对应关系。3.通过检测不同免疫抑制剂单一和/或联合用药情况下,宿主PBLs MHC-Ⅰ/-ⅡmRNA表达的变化,探索免疫抑制剂剂量与宿主PBLs MHC基因表达之间的关系;并分析MHC-ⅠmRAN表达与环孢霉素A（CsA）血药浓度之间的关系,探讨移植受者外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRAN的表达能否作为评估机体免疫抑制程度的监测参数,从而为指导临床免疫抑制剂的个体化用药提供依据。4.通过与目前学术界已证实的移植排斥反应的无创性指标（外周血淋巴细胞HLA-DR、FasL）进行比较,探讨Real Time PCR方法检测移植受者外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRNA表达作为监测急性移植排斥反应无创性指标的可行性,筛选诊断AR的敏感指标。方法:1.Real Time PCR检测方法的建立。依据GenBank中小鼠MHC mRNA序列,根据MHC-Ⅰ/-Ⅱ基因外显子4、5中的保守序列自主设计筛选引物;以管家基因β-actin作为内参照,设计引物。运用SYBR GreenⅠ嵌合荧光Real Time PCR定量检测技术扩增MHC mRNA的表达。2.在第一部分（外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ与急性排斥的研究）研究中,将225只SPF（Specific Pathogen Free,无特殊病原菌）级近交系C57BL/6小鼠（组织相容性基因:H-2b）和BALB/C小鼠（组织相容性基因:H-2d）随机分为2组。对照组（n=30,30只正常健康的BALB/C小鼠作为皮肤移植术前对照）;实验组（n=195,移植未用药）:包括Ea组（n=65,同种异基因移植BALB/C组,H-2b to H-2d）,Eb组（n=65,同种异基因移植C57BL/6组,H-2d toH-2b）和Ec组（n=65,同种同基因移植组,H-2d to H-2d）。其中各实验组根据采血时间不同又分为术后不同时间组,每组5只小鼠。采用经典的小鼠皮肤移植排斥模型,标准方法进行皮肤移植手术。对上述各组分别采用实时荧光定量PCR方法连续检测移植受者PBLs MHC-Ⅰ（包括H-2K,H-2D）、MHC-Ⅱ（包括H-2Ia,H-2Ie）和FasL mRNA表达水平的变化,流式细胞术检测CD8+T细胞MHC-Ⅰ类抗原（H-2K）和MHC-Ⅱ类抗原（H-2Ia）的表达,H-E常规病理切片连续监测移植物发生排斥反应的组织学改变,并记录病理分级情况与排斥反应发生的时间。3.在第二部分（免疫抑制剂剂量对外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ表达的影响）研究中,首先,本实验研究了不同剂量免疫抑制剂对非移植手术小鼠PBLs MHC基因表达的影响。将90只SPF级近交系BALB/C小鼠随机分为4组。对照组（n=20,包括10只正常健康的BALB/C小鼠作为用药前对照组和10只给予安慰剂处理的小鼠作为实验对照组）和实验组（n=70,包括环孢素A（CsA）单一用药组,强的松（Pred）单一用药组,CsA和强的松联合用药组）;同时以上各实验组又包括不同剂量组:10mg/kg/day,20 mg/kg/day,40 mg/kg/day,60mg/kg/day,80 mg/kg/day,每组5只小鼠。对上述各组分别采用实时荧光定量PCR方法检测用药的非移植小鼠PBLs MHC-Ⅰ（H-2K,H-2D）和MHC-Ⅱ（H-2Ia,H-2Ie）mRNA表达水平的变化,探索可引起宿主PBLs MHC-Ⅰ基因表达下降的免疫抑制剂剂量,荧光偏振免疫分析法（FPIA）检测不同剂量CsA血药浓度的变化。其次,本实验还研究了不同剂量免疫抑制剂对移植手术小鼠PBLs MHC基因表达的影响。将285只SPF级近交系C57BL/6小鼠（组织相容性基因:H-2b）和BALB/C小鼠（组织相容性基因:H-2d）随机分为2组:对照组（n=30,30只正常健康不用药的BALB/C小鼠作为移植术前对照）和实验组。其中,实验组（n=255,移植用药组）包括:Ea组（n=85,同种异基因移植小剂量用药组,H-2b to H-2d,CsA 30mg/kg+Pred 30mg/kg）、Eb组（n=85,同种异基因移植大剂量用药组,H-2b to H-2d,CsA 60mg/kg+Pred 60mg/kg）和Ec组（n=85,同种同基因移植用药组,H-2d to H-2d,CsA 30mg/kg+Pred30mg/kg）。其中各实验组根据采血时间不同又分为术后不同时间组,每组5只小鼠。结果:1.实验小鼠一般情况和移植物肉眼观察以及组织病理学改变全部存活的实验小鼠一般状况良好,体重略有增加。同种同基因（同系）移植小鼠呈现移植耐受状态,无排斥现象发生,移植物的大体观察及组织病理学检查与移植前相比均无明显改变。与同系移植组不同,同种异基因（异系）移植小鼠均出现严重的排斥反应。当皮肤移植物变黑、变硬,边缘翘起,出现组织坏死,皮片面积缩小至原来的60%以上时,定为完全排斥。肉眼观察移植未用药BALB/C品系和C57BL/6品系组小鼠发生完全排斥的时间均为术后第11天左右,皮肤移植物平均存活时间（MST）为8.20±1.04,而移植用药小剂量组小鼠皮肤移植物发生完全排斥的时间为移植术后第18天左右,移植物MST为17.05±1.17,移植用药大剂量组小鼠皮肤移植物发生完全排斥的时间是移植术后第25天左右,移植物MST为25.08±1.11,与移植未用药小鼠相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。对移植小鼠的皮肤移植物进行局部组织学活检,经H-E染色后,组织病理学切片发现:与同系移植小鼠局部组织学无改变不同,异系移植小鼠移植皮片可见表皮及真皮层出现不同程度淋巴细胞和单核细胞的浸润。根据细胞浸润程度的不同将排斥反应的组织学改变分为病理Ⅰ-Ⅳ级。移植物组织病理学改变与移植排斥反应发生时间的对应关系为:移植未用药组、移植用药小剂量组和移植用药大剂量组分别于移植术后第2-4天、第2-8天和第2-15天出现轻微排斥,镜下可见少量的淋巴细胞和单核细胞浸润,为病理排斥Ⅰ级;于术后第5—8天、第9—15天和第16—22天出现轻度排斥,为病理Ⅱ排斥级;于术后第9-11天、第16-22天和第23天以后出现中度排斥,为病理排斥Ⅲ级;未用药和小剂量组于术后第12-14天、第23-26天出现重度排斥,为病理排斥Ⅳ级,而大剂量组由于受到实验时间的限制,尚未检测到重度排斥的发生。2.移植受者PBLs MHC mRNA表达在急性移植排斥反应过程中的变化规律。同系移植组小鼠PBLs MHC表达无明显变化。但是,异系移植组BALB/C品系和C57BL/6品系小鼠与移植排斥反应发生进程相一致,外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ/-ⅡmRNA表达均出现上调现象,其表达呈双峰升高的趋势,与未排斥小鼠相比差异有统计学意义。移植未用药组于术后第4—8天形成第1个峰,第9天逐渐降低之后又形成第2个峰,但在第9天表达的谷底水平仍高于术前水平。当给予移植受者免疫抑制药物后,小剂量用药异系移植组小鼠PBLs MHC-Ⅰ/-ⅡmRNA表达也升高,分别于术后第7—13天形成第1个峰,第15天左右出现第2个峰;其中第1个峰对应排斥反应病理分级的Ⅰ—Ⅱ级,第2个峰对应病理Ⅲ-Ⅳ级。而大剂量用药异系移植组小鼠由于CsA的强力免疫抑制作用使移植受者免疫功能状态明显受抑制,PBLs MHC-ⅠmRNA表达也有升高,与非排斥小鼠相比差异有统计学意义,但升高的幅度小,且出现的时间明显晚于小剂量组,升高表达呈单峰形式出现于移植术后第20天左右。AR发生时,异系移植（未用药和用药）组与同系移植组相比PBLs MHC-ⅠmRNA表达升高明显（P＜0.05）。以异系移植未用药组为例,PBLs MHC-ⅠmRNA升高表达出现的时间早,发生于移植术后第4天（排斥反应的早期阶段）,对应排斥病理分级的Ⅰ-Ⅱ级,比肉眼观察移植物出现完全排斥的时间早5-8天;升高表达持续移植排斥反应的整个过程,直至术后第13天移植物完全排斥为止,表明检测窗口期（明显检测到MHC-ⅠmRNA表达升高的时间）长;检测窗口期的敏感性较高（93.84%,61/65）。排斥反应发生时,异系移植（未用药和用药）组与同系移植组相比PBLs MHC-ⅡmRNA表达也显著升高（P＜0.05）,但与MHC-ⅠmRNA表达不同的是:MHC-ⅡmRNA升高表达出现的时间明显晚于MHC-ⅠmRNA,分别出现于移植术后第11天和第15天。3.流式细胞术检测结果显示,当排斥反应发生时,异系移植未用药组小鼠CD8+T细胞H-2K、H-2Ia抗原平均荧光强度（MFI）与术前对照组相比呈升高表达趋势,但差异不明显。异系移植用药小剂量组CD8+T细胞H-2K、H-2Ia抗原MFI在免疫抑制剂的作用下出现明显下调,但当排斥发生时H-2K、H-2Ia抗原MFI明显高于移植前水平和非排斥组表达水平（P＜0.05）,表明免疫抑制剂（CsA和强的松联合用药）可明显下调外周血淋巴细胞表面MHC-Ⅰ/-Ⅱ抗原的表达。4.对PBLs MHC-ⅠmRNA表达与其他公认的移植排斥反应的无创性指标进行比较,结果显示:与同系移植（未用药和用药）非排斥组相比,异系移植（未用药和小剂量用药）排斥组小鼠PBLs H-2Ie（相当于人类HLA-DR）)mRNA表达显著升高（P＜0.05）分别出现于移植术后第11天和第15天。同样,PBLs FasLmRNA表达排斥组较非排斥组也明显升高（P＜0.05）,分别出现于移植术后第9-13天和第15天左右,对应排斥病理分级的Ⅲ-Ⅳ级。因此,当急性移植排斥反应发生时,移植受者PBLs MHC-ⅠmRNA（尤其H-2K基因位点）表达升高出现的时间明显早于MHC-Ⅱ和FasL mRNAs的表达,且检测窗口期长,表明PBLsMHC-ⅠmRNA表达更能早期监测移植排斥反应的发生。5.不同剂量免疫抑制剂对非移植手术小鼠PBLs MHC基因表达影响的结果。CsA单一用药对宿主PBLs MHC-Ⅰ基因表达的影响,与给药剂量有关;但对宿主PBLs MHC-Ⅱ基因表达的影响,与给药剂量无关。在血药浓度稳定的初期,小剂量CsA（10,20,40mg/kg/day）单一用药可升高小鼠PBLs MHC-Ⅰ（H-2K,H-2D）mRNA表达,而大剂量CsA（60,80 mg/kg/day）单一用药可降低小鼠PBLs MHC-ⅠmRNA表达。研究中所使用的任何一个剂量的强的松单一用药以及CsA和强的松联合用药均可降低宿主PBLs MHC-Ⅰ/Ⅱ基因mRNA的表达。6.不同剂量免疫抑制剂对移植手术小鼠PBLs MHC-ⅠmRNA表达影响的结果。当排斥反应发生时,与对照组相比,小剂量和大剂量CsA和强的松联合用药异系移植组小鼠PBLs MHC-ⅠmRNA表达均升高,但大剂量组PBLs MHC-ⅠmRNA升高表达出现的时间明显晚于小剂量组,而且升高的幅度也比小剂量组低。从量-效关系上看,大剂量用药异系移植小鼠皮肤移植物的平均存活时间（MST）比小剂量用药和未用药异系移植小鼠的MST明显延长（P＜0.01）。从剂量与MHC基因表达的关系来看,大剂量CsA和强的松联合用药显著降低了宿主PBLs MHC-ⅠmRNA的表达,但当排斥反应发生时,异系移植排斥小鼠PBLs MHC-ⅠmRNA表达较非排斥小鼠明显升高,这说明研究所使用的免疫抑制剂剂量还不足以完全抑制机体对同种异体抗原的免疫反应,但可以延缓机体排斥反应的发生,表现为宿主PBLs MHC-ⅠmRNA表达升高出现的时间明显延迟,表明免疫抑制剂降低移植术后宿主PBLs MHC-ⅠmRNA表达水平与其应用剂量有关。结论:1.Real Time PCR方法连续动态检测移植受者外周血淋巴细胞MHC-Ⅰ（尤其H-2K基因位点）mRNA表达有助于早期发现急性移植排斥反应的发生。2.大样本的动物实验,研究发现:移植受者外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRNA表达上调与急性移植排斥反应密切相关。3.移植受者外周血淋巴细胞MHC-ⅠmRNA在排斥反应的早期阶段,呈稳定性高表达,且检测窗口期长,优于其它的诊断指标（MHC-Ⅱ,FasL）,可作为诊断早期移植排斥反应的无创性指标。
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