临床标本中是否存在沙眼衣原体噬菌体的探索

论文摘要

沙眼衣原体（C.T）是专性活细胞类寄生,以二分裂方式繁殖形成包涵体的原核微生物。人类是C.T的自然宿主,它主要寄生于机体粘膜上皮细胞,可以导致人体的多种疾病。沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, CT）所引起的泌尿生殖道感染已成为近年来国内外最常见的性传播疾病。它迁延难愈、并发症多且无有效的疫苗,使其成为全社会关注的公共健康问题。C.T感染的研究是国内外研究的热点、重点,我们迫切需要强有力的预防和控制措施以改善沙眼衣原体感染和流行的现况。衣原体噬菌体被国际社会公认为有希望作为解决这一难题的有效手段,但尚未为发现沙眼衣原体噬菌体。衣原体噬菌体是一种侵袭衣原体的病毒,它可使衣原体病变解体,属于单股DNA病毒中的微病毒科。目前已发现了六种衣原体噬菌体Chp1、Chp2、Chp3、Chp4、ΦCPAR39和ΦCPG1,C.T尚无携带噬菌体的报道。根据衣原体的系统发生树,沙眼衣原体和鹦鹉热嗜衣原体都是比肺炎嗜衣原体更加古老的衣原体,而且结构复杂,分型更多。相对新的简单的肺炎嗜衣原体都有其噬菌体,那么,古老而复杂的沙眼衣原体应与类似的鹦鹉热衣原体一样有其噬菌体。如果能发现,其临床价值令人期待。噬菌体是否能吸附到相应的敏感衣原体外膜上取决于衣原体外膜上的受体蛋白和噬菌体本身的衣壳蛋白Vp123间的相互作用.其中Vpl是主要的衣壳蛋白,分子量最大,不同衣原体噬菌体的Vpl蛋白多肽序列在相似位置处仅小部分序列高度差异,其他区域的序列又高度保守,可作为C.T寻找衣原体噬菌体的良好标志物。目的：收集各种不同状态下的标本,试图通过筛查临床分泌物标本中编码衣原体噬菌体Vpl蛋白的Vpl基因和血清标本中VP1蛋白的抗体,发现具有重大理论及现实意义的沙眼衣原体噬菌体,为解决沙眼衣原体感染临床难题奠定基础。方法：收集天津性传播疾病研究所就诊患者的分泌物标本和血清标本。应用生物信息技术设计沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白Vpl基因的引物,PCR扩增分泌物标本中的C.T噬菌体Vpl基因,凝胶电泳检测扩增的DNA,克隆后的Vpl片段进行序列测定及网上BLAST。Vpl基因得以扩增的标本,进一步进行McCoy细胞培养（单独McCoy培养及与E型标准株的混合培养）,再用已制备的衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白VP1单抗通过免疫荧光检测标本中衣原体噬菌体Vp1蛋白的存在。以纯化过的衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1为抗原,通过ELISA法和Western印迹法检测临床血清标本中VP1抗体的存在。结果：共收集临床分泌物标本1542例,其中C.T（+）患者859例,C.T（-）患者683例；36例成功扩增出衣原体噬菌体衣壳蛋白Vp1基因,其中C.T（+）标本28例,C.T（-）标本8例。测序结果显示：扩增所得的Vp1基因序列与最终设计的引物目标片段仅4或5个碱基位点的差异,以NCBI blast网上检索与衣原体噬菌体phiCPG1,chp4,phi CPAR39,chp3,chp2,序列的覆盖率和相似度均在90%以上。免疫荧光法检测了36份Vp1gene初筛阳性的分泌物标本,未发现其中有衣原体噬菌体Vp1蛋白的存在。用Vp1蛋白作为抗原通过间接ELISA法共筛查459例患者的血清,其中267例C.T（+）患者的血清,17例检出Vp1蛋白抗体。测定186例正常人血清,6例检出Vp1蛋白抗体。应用Western印迹法对上述23例ELISA阳性血清进行Vp1蛋白抗体鉴定,发现6例血清中有Vpl特异性抗体,其中5例为C.T（+）患者的血清,1例为正常人血清。结论：利用自行设计的C.T噬菌体Vp1基因的引物,从临床分泌物标本中成功扩增出C.T噬菌体Vp1基因片段；以纯化的衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1为抗原,成功检测到了临床血清标本中C.T噬菌体Vp1蛋白抗体的存在。免疫荧光未能检测到活的沙眼衣原体噬菌体菌株,有待进一步研究探索。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、临床标本C.T噬菌体Vpl基因检测
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 C.T的检测结果
• 1.2.2 衣原体噬菌体Vp1基因的扩增结果
• 1.2.3 衣原体噬菌体Vp1基因产物测序及blast结果
• 1.3 讨论
• 1.3.1 关于PCR法检测衣原体噬菌体Vp1基因的结果
• 1.3.2 关于引物的设计问题
• 1.3.3 关于PCR扩增的讨论
• 1.4 小结
• 二、血清标本中衣原体噬菌体Vp1蛋白的检测
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 ELISA检测衣原体噬菌体Vp1蛋白的抗体
• 2.2.2 Westernblot方法鉴定衣原体噬菌体Vp1蛋白
• 2.3 讨论
• 2.3.1 ELISA法初筛抗体
• 2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳
• 2.3.3 Western印迹法检测Vp1蛋白抗体
• 2.4 小结
• 三、免疫荧光法检测标本中衣原体噬菌体Vp1蛋白
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 McCoy细胞培养
• 3.2.2 用已制备的Vp1单克隆抗体检测衣原体噬菌体的结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 衣原体噬菌体的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢