小麦赤霉病菌G蛋白β和γ亚基及SNARE蛋白VAM7功能分析

论文摘要

小麦赤霉病是世界性的麦类病害,每年给麦类的生产带来严重损失。同时被侵染的麦类含有DON及ZEA毒素,有害人类的健康。赤霉病由小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）引起,因此开展该病原菌毒素产生机理及致病机制的研究具有重要意义。异三聚体G蛋白（简称G蛋白）在真核生物中广泛存在并且很保守,在信号传递过程中主要起分子开关的作用,参与细胞多种生命活动。在稻瘟病菌、板栗疫病菌和尖孢镰刀菌等3种植物病原真菌中的研究发现,G蛋白对菌丝生长、色素合成、分生孢子形成及萌发、病菌的有性生殖及致病性均具重要的调控作用。由于G蛋白的β亚基和γ亚基在小麦赤霉病菌生长发育、致病过程中的作用机制尚不十分清楚。为了澄清这种作用机制,本文从病菌中克隆到G蛋白的β亚基和γ亚基两个基因,分别命名为GzB1和GzG1。Southern杂交结果显示,GzB1和GzG1在G. zeae基因组中均为单拷贝。进一步通过基因敲除的方法获得Gβ和Gγ的敲除突变体,研究发现△GzB1和△GzG1突变体的分生孢子均是单极性萌发,突变体毒素合成能力下降,在番茄上丧失定殖能力,丧失了对小麦穗部的致病能力；△GzG1突变体的生长速率及孢子产量与野生型和△GzB1突变体相比均显著下降；△GzB1失去了胞外多聚半乳糖醛酸酶活性。SNARE蛋白是一类在真核生物中十分保守的蛋白,在真核生物膜泡的运输和融合中具有重要作用。液泡是膜泡运输过程中重要的细胞器,参与细胞金属离子解毒、渗透压平衡、营养胁迫耐受等调节过程。本文从赤霉病菌中克隆了一个编码SNARE蛋白的基因,命名为GzVAM7,其被认为是VAM7的同系物。GzVAM7含有的SNARE结构域与啤酒酵母Vam7p的SNARE结构域同源性高达29%,与玉米黑粉病菌的Yup1同源性高达40%。Sourthern杂交表明该基因在小麦赤霉病菌基因组中为单拷贝。进一步研究发现,GzVAM7敲除突变体的孢子及幼嫩菌丝的液泡呈碎片状。突变体对金属离子、营养、渗透压胁迫表现敏感,表明突变体在液泡功能上存在缺陷。细胞膜胁迫因子分析发现,突变体对SDS敏感。FM4-64染色在突变体中不能够观察到菌丝顶端的顶体结构。FM4-64跟踪试验表明突变体细胞胞吞作用在一定程度上被阻断,BFA处理可以部分恢复GzVAM7敲除突变体的胞吞作用,表明GzVAM7参与小麦赤霉病菌的胞吞作用,且BFA作用于其下游。同时年发现突变体存在严重的产孢缺陷,且丧失了在番茄上的定殖能力和对小麦麦穗的致病力。综上研究表明GzVAM7既可以维持液泡形态和功能,调控胞吞作用,在小麦赤霉病菌的生长、发育、致病性过程中是一个功能多样化的SNARE蛋白。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）的概况
• 1 小麦赤霉病病源、病症和防治
• 2 禾谷镰刀菌（Gibberella zeae）致病基因的研究概述
• 2.1 赤霉病菌的遗传转化
• 2.2 小麦赤霉病菌功能基因的研究
• 参考文献
• 第二章 异三聚体G蛋白与SNARE蛋白VAM7在真菌生长发育与致病中的功能研究
• 1 G蛋白在真菌中的相关研究
• 1.1 G蛋白的结构及分类
• 1.2 异三聚体G蛋白在真菌生长发育与致病中的功能研究进展
• 1.3 卵菌的G蛋白研究
• 2 SNARE蛋白及VAM7基因的研究
• 2.1 SNARE蛋白的结构
• 2.2 VAM7在真核细胞液泡融合中的作用及真菌中的研究
• 参考文献
• 下篇 研究内容
• 第一章 小麦赤霉病菌G蛋白β和γ亚基功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株及培养条件
• 1.2 赤霉病菌DNA、RNA提取和cDNA合成
• 1.3 GzG1蛋白序列分析
• 1.4 Southern杂交
• 1.5 赤霉病菌基因敲除载体构建和赤霉病菌原生质体转化
• 1.6 赤霉病菌转化子验证
• 1.7 小麦病菌敲除转化子表型分析
• 1.8 突变体DON和3-ADON毒素产量的测定
• 1.9 突变体的胞外多聚半乳糖醛酸酶的活性分析
• 1.10 突变体突变体的致病性分析
• 1.11 突变体的基因互补实验
• 2 结果
• 2.1 GzG1编码小麦赤霉病菌G蛋白β亚基
• 2.2 赤霉病菌GzB1和GzG1敲除转化子的获得
• 2.3 小麦赤霉病菌ΔGzB1和ΔGzG1突变体菌丝生长速率和色素形成能力下降,分生孢子产量发生改变
• 2.4 GzB1和GzG1在孢子萌发中调控孢子的极性
• 2.5 ΔGzB1和ΔGzG1突变体产生DON、3-ADON毒素的能力下降
• 2.6 小麦赤霉病菌ΔGzB1胞外多聚半乳糖醛酸酶活性丧失,两个突变体在创伤番茄果实上不能定殖
• 2.7 ΔGzB1和ΔGzG1突变体丧失了在小麦穗部的致病性
• 2.8 野生型基因可以互补突变体多方面的缺陷
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 小麦赤霉病菌SNARE蛋白VAM7功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株及培养条件
• 1.2 赤霉病菌DNA、RNA提取和cDNA合成
• 1.3 GzVAM7蛋白序列分析
• 1.4 Southern杂交
• 1.5 赤霉病菌基因敲除载体构建和原生质体转化
• 1.6 赤霉病菌转化子验证
• 1.7 小麦赤霉病菌敲除转化子菌丝生长表型分析
• 1.8 突变体产孢量测定
• 1.9 突变体菌丝干重的测定
• 1.10 FM4-64对突变体胞吞作用的观察分析
• 1.11 BFA预处理观察突变体菌丝胞吞作用
• 1.12 突变体的孢子萌发情况
• 1.13 突变体DON和3-ADON毒素产量的测定
• 1.14 突变体的胞外多聚半乳糖醛酸酶的活性分析
• 1.15 突变体的致病性分析
• 1.16 突变体的基因互补实验
• 2 结果与分析
• 2.1 赤霉病菌GzVAM7编码一个SNARE蛋白
• 2.2 GzVAM7敲除突变体的获得
• 2.3 小麦赤霉病菌中GzVAM7突变体影响菌落形态、菌丝的分枝及生物量,在分生孢子的形成过程中起重要的调控作用
• 2.4 GzVAM7调控小麦赤霉病菌分生孢子萌发的极性
• 2.5 GzVAM7基因敲除突变体在液泡功能和结构上存在缺陷
• 2.6 GzVAM7突变体胞吞作用受阻,无顶体结构形成
• 2.7 GzVAM7突变导致小麦赤霉病菌DON及3-ADON毒素产生能力降低
• 2.8 小麦赤霉病菌ΔGzVAM7突变体胞外多聚半乳糖醛酸酶活性没有变化,突变体在番茄果实上的定殖能力丧失
• 2.9 ΔGzVAM7突变体丧失在小麦穗部的致病能力
• 2.10 赤霉病菌ΔGzVAM7突变体的互补实验
• 3 讨论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢