论文摘要
低温是植物生长过程中经常遇到的一种非生物胁迫。利用分子生物学手段提高植物抗寒能力已成为近年来研究的热点。随着抗寒基因的不断发现,已有将抗寒基因导入植物中并获得具有抗寒能力转基因植株的报道。在植物抗寒基因的研究中,导入抗寒相关基因COR（cold regulated）的转录激活因子已成为一个新的思路。CBF（C-repeat bindingfactor）基因能够识别并与COR基因启动子区域的CRT/DRE（C-repeat/dehydrationresponsive element）顺式作用元件特异结合,诱导其表达,从而提高植物的抗寒能力。CBF类基因能够综合改良植物的抗逆性状,已成为植物抗寒分子育种的研究热点。本研究采用RT-PCR技术对山葡萄转录因子CBF3基因进行克隆与序列分析;构建了CBF3原核表达载体pGEX-4T-CBF3,研究了其在大肠杆菌中融合表达的情况;构建了山葡萄转录因子CBF3基因的植物表达载体pRCBF3。主要研究结果如下:1.通过设计特异性引物,采用RT-PCR技术对山葡萄低温诱导转录因子CBF3基因进行了克隆（提交GenBank接受序列号为EU672969）,得到854bp的cDNA序列。对CBF3基因进行生物信息学的分析表明,山葡萄CBF3基因开放阅读框为720bp,编码239个氨基酸;Blastp分析表明山葡萄CBF3基因具有AP2结合域;预测该蛋白相对分子质量为25 914.7、等电点为7.02、脂肪系数为59.29、总平均疏水性为-0.551;在119～137位之间和203～225位之间各含有一个疏水性区域和跨膜区;预测二级结构主要是无规则卷曲,蛋白不稳定。2.构建了山葡萄CBF3基因的原核表达载体pGEX-4T-CBF3,转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21（DRE3）。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果表明转化菌表达出52KDa左右的融合蛋白。3.构建了山葡萄CBF3基因的植物表达载体pRCBF3,将其转化到农杆菌LBA4404中。
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摘要Abstract1 绪论1.1 引言1.2 植物抗寒冻基因工程研究进展1.2.1 导入抗寒功能基因的研究1.2.2 导入抗寒调控基因的研究1.3 转录因子CBF研究进展1.3.1 CRT/DRE顺式作用元件的发现1.3.2 CBF基因的发现及其结构特点1.3.3 CBF基因的表达及对抗冻基因的调控1.3.4 CBF基因在植物抗寒中的作用1.4 本研究的目的、意义2 山葡萄CBF3基因克隆及生物信息学分析2.1 试验材料2.1.1 植物材料2.1.2 菌种2.1.3 酶和生化试剂2.1.4 引物2.1.5 试剂和培养基配方2.2 试验方法2.2.1 山葡萄叶片总RNA的提取2.2.2 山葡萄叶片总RNA RT-PCR扩增合成cDNA2.2.3 cDNA的PCR扩增2.2.4 CBF3基因克隆与测序2.2.5 CBF3基因生物信息学分析2.3 结果与分析2.3.1 山葡萄叶片总RNA的提取2.3.2 山葡萄叶片总RNA的RT-PCR扩增2.3.3 重组质粒的鉴定2.3.4 目的基因的测序结果及生物信息学分析2.4 本章小结3 山葡萄CBF3基因原核表达初步研究3.1 引言3.2 试验材料3.2.1 菌株和载体3.2.2 酶和试剂3.2.3 试剂配方3.3 试验方法3.3.1 质粒的提取3.3.2 目的基因的PCR扩增3.3.3 载体质粒和目的基因的双酶切3.3.4 目的基因和pGEX-4T-2质粒酶切产物的连接3.3.5 连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3）3.3.6 转化子的鉴定3.4 重组质粒pGEX-4T-CBF3的诱导表达3.4.1 诱导表达3.4.2 重组菌菌体的裂解3.4.3 SDS-PAGE检测融合蛋白表达3.4.4 考马斯亮蓝染色3.5 结果与分析3.5.1 质粒提取3.5.2 目的基因的PCR扩增3.5.3 原核表达载体和目的基因的双酶切3.5.4 重组表达载体的构建与检测3.5.5 目的基因在大肠杆菌中融合表达3.6 本章小结4 CBF3基因植物表达载体的构建4.1 试验材料4.1.1 菌种和质粒4.1.2 酶和生化试剂4.1.3 引物4.1.4 主要试剂的配制4.2 CBF3基因植物表达载体的构建4.2.1 中间表达载体的构建4.2.2 冻融法将中间表达载体导入根癌农杆菌4.3 结果与分析4.3.1 目的基因的PCR扩增4.3.2 目的基因及pROK Ⅱ的双酶切4.3.3 中间表达载体的鉴定4.3.4 中间载体导入农杆菌的PCR鉴定4.4 本章小结结论参考文献附录A 图版附录B 测序结果附录C CBF3基因原核表达载体构建流程图附录D CBF3基因植物表达载体构建流程图攻读学位期间发表的学术论文致谢
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标签：山葡萄论文; 基因克隆论文; 载体构建论文; 原核表达论文;
