论文摘要
目的:利用RNA干扰（RNAi）技术设计、构建小鼠VEGF特异的RNAi表达体系pSilencer4.1 CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA,研究该表达体系抗BALB/c小鼠结肠癌生长及转移的作用,以探索结肠癌基因治疗的新途径。方法:1.针对VEGF mRNA序列,筛选、设计、合成siRNA相关基因片段,构建特异的siRNA表达载体pSilencer4.1 CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA,双酶切鉴定及测序验证插入序列的正确性。2.CT-26细胞分为转染重组质粒V1组（V1组）、重组质粒V2组（V2组）、重组质粒V3组（V3组）Lipofectamine组（Lp组）、空白细胞组（c组）、Scrambled组（Nc组）,脂质体法基因转染小鼠结肠癌CT-26细胞,半定量RT-PCR、Western blot法、流式细胞技术检测siRNA阻断VEGF mRNA转录和VEGF蛋白表达的效率,应用MTT比色分析法和流式细胞技术观察siRNA阻断VEGF基因表达对CT-26细胞增殖、细胞周期分布及细胞凋亡的影响;3.小鼠分为转染重组质粒V1组（V1组）、重组质粒V2组（V2组）、重组质粒V3组（V3组）、生理盐水组（V0组）,用CT-26细胞建立结肠癌皮下动物模型,建模同期通过异位接种肿瘤的皮下给真核表达质粒V1、V2、V3及生理盐水,观察各组小鼠体重变化及肿瘤生长情况;接种CT-26细胞2周后处死全部小鼠,完整剥离肿瘤,称重、测体积,免疫组织化学法检测肿瘤VEGF表达及微血管密度,半定量RT-PCR、Western blot法检测肿瘤组织VEGF mRNA转录和VEGF蛋白表达。4.小鼠分为转染重组质粒V1组（V1组）、重组质粒V2组（V2组）、重组质粒V3组（V3组）、生理盐水组（V0组）,从脾脏下极包膜内接种CT-26细胞,建立结肠癌肝脏转移动物模型,建模同期给予真核表达质粒V1、V2、V3腹腔注射,观察各组小鼠体重变化;接种CT-26第19天后处死全部小鼠,取出肝脏和脾脏,称重,病理学检查,体视学计数肝脏肿瘤转移灶,免疫组织化学法检测肝脏肿瘤VEGF表达及微血管密度。5.小鼠分为转染重组质粒V1组（V1组）、重组质粒V2组（V2组）、重组质粒V3组（V3组）、持续低级剂量希罗达组（X组）、生理盐水组（V0组）,用CT-26细胞建立结肠癌皮下动物模型,建模同期通过异位接种肿瘤的皮下给真核表达质粒V1、V2、V3、生理盐水及小剂量希罗达灌胃,观察各组小鼠体重变化及肿瘤生长情况;接种CT-26细胞2周后处死全部小鼠,完整剥离肿瘤,称重、测体积,免疫组织化学法检测肿瘤VEGF表达及微血管密度,Western blot法检测肿瘤组织VEGF蛋白表达。结果:1.成功构建针对小鼠VEGFmRNA序列siRNA表达载体:pSilencer4.1CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA,并经酶切及测序鉴定完全正确。2.重组质粒脂质体法转染CT-26细胞,RT-PCR和Western Blot检测V1、V2、V3组肿瘤细胞VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达较Lp组、c组、Nc组明显下降,其间差异有统计学意义（P＜0.01）,其中又以V1、V2基因沉默效率优于V3（P＜0.05）。3.MTT分析结果显示V1、V2、V3组肿瘤细胞的生长较Lp组、c组、Nc组被明显抑制,其间差异有统计学意义（P＜0.01）,其中,又以V1、V2组肿瘤细胞生长被抑制为明显,与V3相比,差异有统计学意义（P＜0.05）;4.流式细胞技术检测:①细胞周期分布分析提示V1、V2组G0/G1期细胞比例较V3组、Lp组、c组、Nc组增高,S期和G2/M期细胞比例降低,其间差异有统计学意义（P＜0.05）。②CT-26细胞VEGF荧光强度检测显示,V1、V2、V3组肿瘤细胞VEGF荧光强度较Lp组、c组、Nc组明显减弱,其间差异有统计学意义（P＜0.01）,其中又以V1、V2组VEGF荧光强度减弱为著,较V3组差异有统计学意义（P＜0.05）;③V1、V2、V3组肿瘤细胞凋亡与Lp组、c组、Nc组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。5.注射重组质粒V1、V2、V3荷瘤小鼠肿瘤体积和重量明显小于V0组（P＜0.05）,肿瘤组织中VEGF表达和微血管密度明显低于V0组;RT-PCR和Western Blot检测V1、V2、V3组肿瘤组织VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达较V0组明显下降（P＜0.01）,其中V1、V2组肿瘤组织VEGF表达、微血管密度、VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达较V3弱（P＜0.05）。6.在对肝转移动物模型中发现,V1、V2、V3组小鼠肝脏肿瘤体积和重量明显小于V0组（P＜0.05）;离体肝脏肿瘤计数V1、V2、V3组较V0组少（P＜0.01）,而V1、V2组又比V3组减少（P＜0.05）。7.在与持续小剂量希罗达（X组）抗肿瘤对照实验中发现,V1、V2、V3组与X组肿瘤体积和重量明显小于V0组（P＜0.05）;肿瘤组织中VEGF表达和微血管密度V1、V2、V3组与X组明显低于V0组（P＜0.01）,而其中V1、V2组、X组又低于V3组（P＜0.05）;Westem blot检测肿瘤组织VEGF蛋白表达V1、V2、V3组、X组较V0组明显下降（P＜0.01）,而V1、V2组、X组又比V3组VEGF蛋白表达弱,其间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.应用表达载体法成功构建VEGF基因特异的siRNA干扰表达体系pSilencer4.1 CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA。2.pSilencer4.1 CMVneo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA经脂质体法转染靶细胞后能显著地发挥基因沉默效应,其中以针对靶基因编码区的siRNA基因沉默效应更为显著。3.注射pSilencer4.1 CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA能使小鼠荷瘤模型中肿瘤生长、肿瘤转移、肿瘤组织血管生成及VEGF表达明显受到抑制,其中以针对靶基因编码区的siRNA效果更为为显著。4.针对靶基因编码区的siRNA沉默VEGF抑制肿瘤组织血管生成及VEGF表达效果与持续小剂量希罗达给药效果相当。5.针对VEGF的RNA干扰技术是一项具有临床应用前景的新型结肠癌基因治疗手段。