论文摘要
抗胰蛋白酶是人体血液中浓度最高的一个丝氨酸蛋白酶抑制剂。它在人的肝脏中合成,主要的生理功能是在肺部阻止嗜中性粒细胞胰肽酶E的活性。在抗胰蛋白酶基因的一个或几个突变会引起血液中抗胰蛋白酶浓度的降低,从而产生肺和肝脏的相关疾病,需要终身补充人源抗胰蛋白酶。因为血液来源的限制和其它的表达体系的重组抗胰蛋白酶表达水平低较低,所以我们应用成熟的水稻种子表达平台表达重组抗胰蛋白酶。研究了重组抗胰蛋白酶的纯化工艺,物理、生化特征,药代动力学及亚细胞定位,并分析了重组抗胰蛋白酶的糖苷修饰结构。由于重组抗胰蛋白酶的表达导致种子产生异常的表型,我们进一步的对影响种子表型变化的分子机理进行了系统的研究。除此之外,通过比较重组抗胰蛋白酶及内源谷蛋白的糖苷修饰结构,分析内质网胁迫对水稻种子中蛋白质糖苷化修饰的影响。主要结果如下：1.本研究通过农杆菌双质粒转化的方法得到23个转基因株系,12株可育,其中9个转基因植株在胚乳中表达重组抗胰蛋白酶,表达量从每千克糙米0.41克到2.24克。2.MALDI-MS分析重组抗胰蛋白酶分子量发现有40.1KDa、44.8KDa、49KDa和53.3KDa四个主要的分子量。圆二色分析重组抗胰蛋白酶的二级结构,证明重组抗胰蛋白酶和人源抗胰蛋白酶有相同的二级结构。N-端序列分析发现重组抗胰蛋白酶和人源抗胰蛋白酶一样存在N-端序列的加工,40.1KDa的重组抗胰蛋白酶是N-端序列缺失11个氨基酸,并且不含有糖苷化修饰的重组抗胰蛋白酶。3.LC-MS分析重组抗胰蛋白酶的糖苷修饰结构检测到11种糖苷结构,GN2XFGN2,GN2M4XGNs,GNM3XFGN2,GNM3XGN2, M3XFGN2, M3XGN2, M2XFGN2, M2XGN2和GNM2GN2[GN=乙酰葡萄糖氨,M=甘露糖,X=木糖,F=岩藻糖],其中复杂类型的糖苷修饰结构占12.8%,杂合类型的糖苷修饰结构占18.7%,Paucimannosidic类型的糖苷修饰结构占64.8%,其它类型的占3.6%。4.通过带迁移实验和猪的胰肽酶E的活性实验证明重组抗胰蛋白酶的活性和人源抗胰蛋白酶是一致的,该结果说明糖苷化修饰的差异和重组抗胰蛋白酶分子的异质性对它的生物活性没有影响。但是重组抗胰蛋白酶的药代动力学研究发现,重组抗胰蛋白酶在大鼠体内很快被清除,而人源重组抗胰蛋白酶在大鼠体内停留时间超过两个小时。5.通过弱阴离子交换、羟基磷灰石和阳离子／疏水复合填料的三步层析柱的纯化方法从水稻种子中分离和纯化重组抗胰蛋白酶,该纯化方案可以从一千克的种子中提取0.37克,纯度达到97%的重组抗胰蛋白酶,回收率达到18.9%。6.重组抗胰蛋白酶在水稻种子中表达影响种子的表型,我们分析了132-10和132-17这两个转基因品系的种子表型和检测重组抗胰蛋白酶mRNA表达水平。实验结果表明,随着重组抗胰蛋白酶表达量的升高,种子的粒长、粒宽、粒厚及千粒重降低。7.用透射电镜分析了水稻胚乳中蛋白体形态,定量PCR分析内质网胁迫相关基因的表达谱。实验结果证明在132-10和132-17这两个转基因品系都产生了内质网胁迫。由于IRE1-Osbzip50言号途径在132-17这个转基因品系被激活,而在132-10没有激活,该实验结果说明132-17中内质网胁迫比132-10更严重。8.通过石蜡切片观察胚乳的结构发现,由于重组抗胰蛋白酶的表达产生内质网胁迫,扰乱了水稻胚乳的发育。通过定量PCR分析细胞程序性死亡相关基因的表达谱及TUNEL实验检测胚乳细胞的程序性死亡,证明在132-10和132-17这两个转基因品系,由于内质网胁迫诱导胚乳细胞的提前细胞程序性死亡,导致在132-17的胚乳发育过程被扰乱,引起了种子千粒重降低及表型异常。9.通过LC-MS分析132-10来源的重组抗胰蛋白酶的糖营修饰结构,并和132-17来源的重组抗胰蛋白酶的糖苷修饰结构进行的比较,发现在132-17这个存在严重内质网胁迫的转基因品系,重组抗胰蛋白酶的N-端序列的加工减少,同时α-（1,3）岩藻糖含量在重组抗胰蛋白酶中也减少,但是β-（1,2）木糖的含量增加。从另外一个角度来看,132-10来源的重组抗胰蛋白酶的复杂和杂合的糖苷结构减少,而paucimannosidic类型的糠苷结构增加,该实验结果说明内质网胁迫会影响重组抗胰蛋白酶糖苷修饰结构的加工。10.通过分析中花11,132-10和132-17中谷蛋白的糖苷修饰结构发现谷蛋白的糖苷修饰结构和重组抗胰蛋白酶糖苷修饰结构大部分是一样的,但是存在一些特有的糖苷修饰结构。如在重组抗胰蛋白酶中没有发现的高甘露糖的糖苷修饰结构在谷蛋白中存在,还有一个明显的差异就是在谷蛋白的糖苷修饰结构中存在β-（1,4）甘露糖和末端的N-乙酰葡萄糖胺连接的结构,这种糖苷修饰结构在重组抗胰蛋白酶中也没有检测到。本研究充分说明,水稻种子表达体系是一个有效的,经济的表达体系,可以表达有生物活性和糖苷修饰的重组抗胰蛋白酶,并且表达的重组抗胰蛋白酶和人源抗胰蛋白酶一样,具有相同的生物活性和二级结构,除此之外,简单,方便的纯化工艺能容易的从水稻种子提取纯度达到97%的重组抗胰蛋白酶。对转基因水稻种子异常的分子机理研究显示内质网胁迫导致水稻胚乳细胞提前程序性死亡,从而造成种子变小及表型异常。对重组抗胰蛋白酶和内源谷蛋白的糖苷修饰结构进行分析再次证明水稻胚乳是一个稳定的表达体系。
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