日本血吸虫：湖北钉螺人工传代及线粒体atp6基因多态性研究

论文摘要

目的1.采用人工方法建立钉螺室内外生存的条件,获得日本血吸虫感染的湖北钉螺,以实现日本血吸虫的室内传代与保种。2.研究湖南省日本血吸虫不同地域自然隔离群线粒体ATP合成酶FO亚单位6(atp6)基因部分序列的遗传多态性,为湖南不同地域自然隔离群日本血吸虫的遗传特性研究提供实验依据。方法1.用尼龙绢筛收集日本血吸虫成熟虫卵,在适当的条件下进行毛蚴孵化。将钉螺与毛蚴按1：15～1：20的比例进行感染,以获得第一代人工感染性钉螺,再以第一代(F1代)人工感染性钉螺逸出的尾蚴感染实验动物,获取成熟虫卵并孵化毛蚴,然后继续感染钉螺,获得第二代(F2代)人工感染性钉螺、同样方法完成第三代(F3代)人工感染性钉螺、第四代(F4代)人工感染性钉螺的传代、…,在实验室内建立血吸虫的传代和保种技术与方法。同时模拟钉螺野外生存环境,建立斜坡型、秧田型和沟渠型三种自然生态养螺池,进行钉螺生存、养殖条件的观察、比较。2.提取日本血吸虫基因组总DNA,以特异性引物对线粒体atp6基因进行PCR扩增,通过单链构象多态性技术(SSCP)筛选出差异带型并进行测序,用DNA Star 5.0及Mega 4.0软件进行比对分析。结果1.成功模拟钉螺野外生存的环境,建立了斜坡型、秧田型、沟渠型三种类型的养螺池,分别投放钉螺3万、2万、4万只,三种类型的螺池中的钉螺均成功越冬并出现了新生幼螺,其中以斜坡型螺池生存条件最佳,其平均幼螺率达到17.17%,实现了人工模拟条件下钉螺的自身繁殖。室内人工传代研究共获得Fl代阳性钉螺796只,F2代阳性钉螺272只, F3代阳性钉螺362只,成功实现了日本血吸虫的室内传代与种质钉螺的保种。2.湖南省5个流行区的日本血吸虫PCR扩增后获得了483 bpatp6部分序列,检测出17个变异位点,变异率为3.52%,雌雄虫之间的差异为0.0～1．3%,不同地理来源虫株间的差异率为0.0～1.5%。聚类分析结果表明：湖南省不同地域自然隔离群日本血吸虫分离株线粒体atp6基因的个体遗传差异明显,尤以泪罗和岳阳君山两地分离虫株表现突出。结论1.人工模拟了野外养殖钉螺条件,建立了三种类型的养螺池,已可以满足日本血吸虫室内传代深入研究的需要。成功实现了日本血吸虫的F1代、F2代、F3代的室内传代,为血吸虫种群的遗传变异、溯源研究创造了条件。2.湖南不同地域自然隔离群日本血吸虫线粒体atp6基因存在明显的个体差异,但是否由于生存环境的选择压力造成了同一地理来源日本血吸虫个体之间atp6基因的遗传差异,其原因有待于进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 前言
• 第—章 日本血吸虫的室内传代及钉螺的模拟野外养殖
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 养螺池改造后的温度记录结果
• 1.2.2 人工感染钉螺的感染率和死亡率结果
• 1.2.3 养螺池产幼螺的观察结果
• 1.3 讨论
• 第二章 湖南省日本血吸虫线粒体基因atp6部分序列的多态性分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 虫体来源
• 2.1.2 主要仪器与试剂
• 2.1.3 虫体材料的处理
• 2.1.4 DNA提取、鉴定
• 2.1.5 atp6部分序列扩增及鉴定
• 2.1.6 琼脂糖电泳鉴定
• 2.1.7 SSCP筛选及鉴定
• 2.1.8 测序
• 2.1.9 变异分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 atp6部分基因SSCP筛选及PCR扩增结果
• 2.2.2 atp6序列测定及其变异
• 2.2.3 种系发育分析
• 2.3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 我国日本血吸虫遗传变异的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果