弓形虫GJS株微线体蛋白3基因的克隆、表达及鉴定

论文摘要

弓形虫（Toxoplasma gondii）为专性细胞内寄生原虫,呈全球分布,引起的弓形虫病是一种严重的人兽共患的寄生虫病,对人类健康和畜牧业生产造成了严重危害。弓形虫病诊断方法和免疫疫苗已成为弓形虫研究的当务之急。微线体蛋白3（Microneme protein3 MIC3）为弓形虫生活史各期均分泌的抗原,具有高度的保守性和免疫原性,作为疫苗候选因子受到人们的关注。根据已发表的弓形虫RH株MIC3的基因序列设计引物,利用PCR技术从弓形虫GJS株基因组中扩增到MIC3基因,通过将产物与pMD-18T载体连接,构建重组质粒pMD-MIC3。基因测序结果表明,本试验所获得的MIC3基因核苷酸序列和所编码氨基酸的序列与GenBank中收录的标准强毒RH株的同源性分别为99.7%和99.2 %。根据MIC3开放阅读框（ORF）序列重新设计一对去掉信号肽编码序列的引物,以重组质粒pMD-MIC3为模板,进行PCR扩增,将扩增产物与pET-30a表达质粒连接,构建了重组原核表达载体pET- MIC3,将其转化到BL21（DE3）宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,所表达的目的蛋白为包涵体。SDS-PAGE和Western-blot分析表明,MIC3基因在大肠杆菌中以包涵体的形式成功获得了表达,分子量大小为44 ku左右,与预期的大小一致,而且可被猪抗弓形虫阳性血清所识别。通过裂解、洗涤、变性、复性等方法对包涵体蛋白进行处理,以电泳切胶回收所获得的纯化产物作为抗原,免疫小鼠制备抗重组蛋白血清。用弓形虫代谢分泌抗原（ESA）和重组抗原分别对抗血清进行间接ELISA检测,小鼠免疫后产生了较高水平的特异性抗体,表明MIC3重组蛋白具有较好的免疫原性。本研究为弓形虫病免疫诊断和疫苗研制提供了候选抗原。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述 弓形虫疫苗的研究进展
• 1. 疫苗种类
• 1.1 全虫疫苗
• 1.2 虫体特异组分疫苗
• 1.3 基因工程疫苗
• 1.4 核酸疫苗
• 1.5 乳酸菌口服疫苗
• 1.6 重组活载体疫苗
• 1.7 其他新型疫苗
• 2. 疫苗佐剂的应用
• 3. 结语
• 第二章 弓形虫 GJS 株 MIC3 基因的克隆、序列分析及表达
• 1. 实验材料
• 1.1 弓形虫 GJS 株速殖子
• 1.2 实验动物
• 1.3 质粒和菌株
• 1.4 主要实验试剂
• 1.5 仪器和设备
• 2. 方法
• 2.1 弓形虫基因组 DNA 的提取
• 2.2 目的基因 MIC3 的扩增
• 2.3 克隆载体的构建
• 2.4 重组质粒的鉴定
• 2.5 表达载体的构建
• 2.6 重组质粒的鉴定
• 2.7 重组质粒的诱导表达
• 2.8 表达产物的 SDS－PAGE 电泳检测
• 3. 结果
• 3.1 目的片断的扩增
• 3.2 pMD-MIC3 重组质粒的鉴定
• 3.3 重组质粒的测序鉴定及序列分析
• 3.4 MIC3 基因及其编码蛋白的结构预测
• 3.5 pET-MIC3 重组质粒的鉴定
• 3.6 MIC3 基因表达产物 SDS-PAGE 分析
• 4. 讨论
• 第三章 MIC3 重组蛋白的纯化及功能分析
• 1. 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要实验试剂
• 1.3 仪器和设备
• 2. 方法
• 2.1 MIC3 基因表达条件的优化
• 2.2 包涵体的提取
• 2.3 包涵体的纯化
• 2.4 表达产物的 Western-Blot 检测
• 2.5 小鼠抗融合蛋白血清的的制备
• 2.6 ELISA 检测抗融合蛋白血清
• 3. 结果
• 3.1 不同诱导条件下基因编码蛋白的表达结果
• 3.2 表达产物的 Western-Blot 分析
• 3.3 小鼠抗融合蛋白血清的 ELISA 检测结果
• 4. 讨论
• 第四章 研究结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介