论文摘要
MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的,随后组装进RNA诱导的沉默复合体,通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径,包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。与动物miRNAs相比,植物miRNAs的研究起步较晚,并且主要集中在全基因组已测序的双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻中。小麦是异源六倍体,共有42条染色体,与拟南芥和水稻相比其基因组非常庞大,迄今仍未被完全测序,因此对其miRNAs的鉴别研究工作存在很大难度,相关的报道也是寥寥无几。但是,小麦是世界上最重要的粮食作物之一,对其miRNAs进行研究仍然具有十分重要的意义,因此本研究拟构建一个小麦小RNAs的cDNA文库,以期克隆到部分小麦miRNAs,为以后大量克隆鉴定小麦miRNAs以及研究其具体功能打下一定的基础。首先从4周龄小麦叶片中大量提取总RNA,并粗提以富集小分子RNA;然后经15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分离,回收并纯化16～28nt范围内的小RNAs;接着,用Poly(A)聚合酶在小RNAs的3′端加一个接头,反转录后再用末端脱氧核苷酰转移酶在cDNAs的3′端加另一个接头,经PCR扩增后纯化回收目的片段并与载体连接;最后,电转化感受态细胞,构建小麦小RNA的cDNA文库。利用菌落PCR对文库进行初次筛选,从筛选到的可能含有目的片段的克隆中随机挑选60个进行测序,得到17条单一的序列;在现有的小麦核酸数据库中搜索这些序列的来源,并用Mfold软件进行二级结构的分析预测,最后获得7个候选的小麦miRNAs。通过Northern blot检测,验证了这些候选miRNAs能够在小麦中表达。根据miRNA的鉴别原则,判定实验克隆到的这7个候选miRNAs为小麦的新miRNAs。