论文摘要
目的：构建编码人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（human Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，hGM-CSF）的慢病毒载体，研究编码hGM-CSF的慢病毒载体对树突状细胞（dendritic cell，DC）疫苗抗肿瘤活性的增强作用。方法：1、以质粒pORFhGM-CSF为模板，采用PCR方法扩增出hGM-CSF基因片段；通过BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点，将hGM-CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体L166中构建重组载体L166-hGM-CSF；2、大量提取重组质粒L166-hGM-CSF和包装载体L205、包膜蛋白L311，采用CaCl2法将这3个质粒共同转染慢病毒包装细胞293T，72h后收集病毒上清，0.45μm负压过滤得到hGM-CSF基因修饰的慢病毒颗粒Lenti-hGM-CSF；同样方法获得编码GFP的慢病毒颗粒Lenti-GFP；3、将收获的慢病毒颗粒Lenti-GFP以不同浓度感染Hela细胞，荧光显微镜下计数绿色荧光的量，由此得到该病毒的滴度；4、采用ELISA方法测定编码hGM-CSF基因的慢病毒Lenti-hGM-CSF感染Hela细胞后hGM-CSF的分泌量；5、从脐血中分离出单核细胞，rhGM-CSF、rhIL-4和α-TNF诱导获得DC，通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定，MTT方法检测DC刺激同种T淋巴细胞增殖能力；6、应用反复冻融法制备可溶性肿瘤抗原，分别将负载肿瘤抗原的DC疫苗和慢病毒Lenti-hGM-CSF感染的负载肿瘤抗原的DC疫苗与T淋巴细胞共同培养，MTT方法检测并比较两者所诱导的CTL对靶细胞的体外杀伤活性。结果：1、通过酶切电泳和测序证实hGM-CSF基因已克隆到慢病毒连接载体L166中；2、收集的慢病毒颗粒感染Hela细胞，病毒滴度达3.2×106IU/ml；3、ELISA法检测慢病毒感染的Hela细胞上清液中hGM-CSF的表达明显高于未感染者，且表达持续时间超过2个月；4、由脐血获得的单核细胞，培养3～5天后有大量细胞悬浮生长，形态不规则，相差显微镜下可见细胞有伸展的大量毛刺，为典型的DC形态。流式细胞（Flow Cytometry，FCM）结果显示高表达CD80（87.2％）和CD86（92.8％），而CD14的表达率较低（3.56％）；5、经慢病毒感染后负载肿瘤抗原的DC疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力和抗肿瘤活性较未转染者明显增强（p＜0.01）。结论：1、成功制备了hGM-CSF基因修饰的慢病毒载体，该慢病毒的滴度和对靶细胞的转染率均较高，且慢病毒携带的hGM-CSF基因可以在靶细胞内持续高水平表达；2、成功从脐血中分离并诱导出DC，通过相差显微镜观察和流式细胞仪检测证实；3、慢病毒Lenti-hGM-CSF感染靶细胞后能够显著增强肿瘤抗原冲击的DC疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力和其诱导的CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。