论文摘要
背景心肌缺血再灌注损伤是临床上冠心病急性心肌梗死再灌注治疗中的难题。目前认为,心肌缺血再灌注损伤属于类炎症反应,白细胞与血管内皮细胞之间的粘附是造成再灌注后心脏微血管“无复流现象”及心肌损伤发生的主要原因。动物实验发现,黄芪多糖具有较好的抗心肌缺血再灌注损伤的作用,但有关其对心脏再灌注损伤过程中细胞粘附分子表达及白细胞与内皮细胞粘附的影响未见报道。目的从细胞粘附分子的蛋白、基因表达及其转录调控的角度,观察黄芪多糖对心脏微血管内皮与中性粒细胞（PMN）的粘附作用,探讨黄芪多糖抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制。方法1人心脏微血管内皮细胞（HCMEC）的培养:经过对HCMEC的复苏、培养、传代,建立稳定的细胞实验平台。2黄芪多糖对正常培养的HCMEC的细胞增殖实验:通过MTT法检测细胞活性变化,观察正常培养下的HCMEC经不同浓度、不同时间的黄芪多糖处理后细胞的增殖情况,以确定安全有效的实验用药浓度。3 HCMEC缺血再灌注损伤模型的建立:以缺氧缺糖模拟缺血,复氧复糖模拟再灌注,通过MTT法比较HCMEC在几种无糖培养基中不同缺氧时间下的存活变化,初步确定HCMEC在此方法下缺氧及再灌注的损伤时间,建立体外HCMEC缺血再灌注损伤模型。4黄芪多糖对缺血再灌注损伤HCMEC与PMN粘附作用的影响:在体外培养的HCMEC缺血再灌注损伤模型的基础上,通过虎红染色法测定粘附的PMN的数量,观察黄芪多糖对上述两种细胞间粘附的影响。5黄芪多糖对HCMEC再灌注损伤ICAM-1、VCAM-1蛋白及基因表达的影响:以免疫细胞化学染色法观察ICAM-1和VCAM-1蛋白表达的变化,并以荧光实时定量PCR法测定ICAM-1和VCAM-1mRNA含量的改变。6黄芪多糖对HCMEC再灌注损伤NF-κB蛋白及基因表达的影响:采用免疫细胞化学染色法观察NF-κB活化时阳性表达核移位的改变;荧光实时定量PCR法定量测定NF-κBmRNA水平的改变。结果1复苏后的HCMEC胞体肥厚、透明,呈菱形或多角形,核小而圆,细胞单层生长,呈铺路石样生长,符合内皮细胞的特征。2 HCMEC经四种不同的无糖造模液培养并缺氧4h、6h、8h后,出现明显损伤（P<0.01）,且缺氧时间越长,OD值越小;再灌16h的D-Hank’s液组和Earle液组,细胞OD值有进一步下降的趋势。3经黄芪多糖干预24h,浓度≥5000μg·mL-1,对正常培养的HCMEC生长具有抑制作用（P<0.05或0.01）;2500μg·mL-1时,对HCMEC的增殖无影响;18.78μg·mL-1～1250μg·mL-1,黄芪多糖可明显促进HCMEC的增殖（P<0.05或0.01）。用25、50、100μg·mL-1的黄芪多糖处理HCMEC4h、6h、8h后,细胞增殖无显著性增加。4 HCMEC单纯缺氧1h、2h,与PMN的粘附有所增加,再灌后6h粘附增加明显,与对照组相比差异显著（P<0.05）;单纯缺氧3h和缺氧3h再灌后6h模型组,内皮细胞与PMN的粘附均降低（P<0.05）。黄芪多糖能降低缺血再灌注损伤后内皮细胞与PMN之间的粘附,其高、中剂量组与模型组比较差异显著（P<0.01）。5黄芪多糖各剂量组均可明显抑制VCAM-1的蛋白表达（P<0.01）,高剂量组还可显著降低ICAM-1的蛋白表达（P<0.05）;黄芪多糖干预后与模型组比,除低剂量组抑制ICAM-1mRNA表达的作用不明显外,其余各组对ICAM-1、VCAM-1基因转录均有明显的抑制作用（P<0.05或0.01）。6光镜下观察,黄芪多糖可显著减少NF-κB的转核活化;荧光实时定量PCR分析,黄芪多糖中剂量组NF-κBp65 mRNA表达量与模型组比较降低明显（P<0.05）。结论1黄芪多糖在一定剂量范围内可适当促进正常培养下的HCMEC增殖,但作用起效较慢。2黄芪多糖对再灌注早期及晚期的细胞粘附都有抑制作用,只是在剂量与效果上有所差异。3黄芪多糖可降低ICAM-1、VCAM-1蛋白和mRNA表达,其中对VCAM-1表达的抑制作用较强。4黄芪多糖可明显减少NF-κB的转核活化,并有效降低NF-κB的基因表达。通过本研究,进一步验证了先前在整体动物研究中得出的黄芪多糖具有抗心肌缺血再灌注损伤的结论,证实黄芪多糖在一定剂量范围内,对体外培养的原代HCMEC缺血再灌注损伤具有保护作用。其作用机制与促进HCMEC的增殖、抑制HCMEC的NF-κB表达及活化,下调ICAM-1、VCAM-1基因和蛋白表达,进而减少与PMN的粘附有关。