本文主要研究内容
作者周昕（2019）在《苦苣菜黄网弹状病毒运动及超侵染排阻机理研究》一文中研究指出：植物弹状病毒(rhabdoviruses)是一类基因组为负链RNA的囊膜病毒(envelopedviruses),广泛为害多种粮食和经济作物,引起严重产量损失。苦苣菜黄网病毒(Sonchus yellow net virus,SYNV)在分类上属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)细胞核弹状病毒属(Nucleorkibabdovirus),是目前研究较为深入的植物弹状病毒。SYNV在细胞核内复制,病毒粒子从内核膜(inner nuclear membrane)出芽后富集于核周腔(perinuclearspace)。侵染植物、昆虫、鱼类和脊椎动物等不同寄主的弹状病毒均以3’-N-P-M-G-L-5’的顺序编码五个保守的病毒结构蛋白,且在基因组复制与转录、出芽(budding)和病毒粒子形成等过程具有类似的特性。此外,植物弹状病毒还编码了一个额外的非结构蛋白,即植物弹状病毒扩散侵染所必须的运动蛋白(movement protein,MP)。长久以来由于反向遗传学体系的缺失,学界对于植物弹状病毒的运动机制知之甚少。本研究以实验室构建的植物弹状病毒侵染性克隆为基础,以SYNV为重点研究对象,探索了病毒胞间运动和长距离运动模式,以及超侵染排阻(superinfectionexclusion,SIE)等现象的分子机制。为了明确SYNV胞间运动方式,我们构建一系列SYNV缺失突变体,包括非结构蛋白sc4、病毒基质蛋白(matrix protein,M)、糖蛋白(Glycoprotein,G)以及M蛋白和G蛋白双缺失突变体,并分析了这些缺失突变体病毒的胞间运动能力。研究结果表明,sc4为SYNV的运动蛋白,其缺失导致SYNV丧失胞间运动能力;M、G以及M和G双缺失突变体依然具有有限的胞间运动能力,从而明确了 SYNV的最小运动单位是其病毒核蛋白(nucleoprotein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和RNA聚合酶(Large polymerase,L)蛋白包裹基因组形成的核衣壳(nucleocapsid,NC)。亚细胞定位分析发现,瞬时表达的SYNVsc4蛋白主要定位于本氏烟表皮细胞的细胞周质(cell periphery),在细胞核内也有少许分布。sc4和高尔基体marker ManI-mCherry、ER 内质网的marker GFP-HDEL、细胞骨架微管marker MAP65-RFP以及细胞骨架微丝marker ABD2-GFP均没有显著的共定位。利用抑制蛋白分泌系统和细胞骨架的药物进行处理发现,20μg/ml的布雷非德菌素A(Brefeldin A,BFA)可以通过破坏内质网网腔结构来抑制SYNV胞间运动,而微管抑制剂氨黄乐灵(Oryzalin)和微丝解聚剂拉春库林B(Latrunculin B,Lat B)则对SYNV胞间运动没有影响。与SYNVN、P蛋白一样,sc4也具有体外非特异性结合单链RNA的能力。BiFC和酵母双杂交均发现sc4与主要核衣壳蛋白N和P蛋白存在互作。我们利用弹状病毒SYNV、马铃薯黄矮病毒(Potato yellow dwarf virus,PYDV)、水稻黄矮病毒(Rice yellow stunt virus,RYSV)、水稻条纹花叶病毒(Rice yellow stunt virus,RSMV)和番茄黄斑驳相关病毒(Tomato yellow mottle-associated virus,TYMaV)编码的MP,分别成功回补了番茄花叶病毒运动蛋白缺失突变体(ToMV-GFPΔMP)和马铃薯X病毒运动蛋白缺失突变体(PVX-GFPΔp25)的胞间运动,表明弹状病毒的运动蛋白和正链RNA病毒的运动蛋白有功能上的相似性。对SYNV运动蛋白缺失突变体(rSYNV-GFPΔsc4)进行反式互补实验发现,除了其自身编码的sc4运动蛋白,其它弹状病毒如PYDV、RYSV、RSMV和TYMaV编码的MP以及黄瓜花叶病毒(Cucumbber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)病毒编码的MP都无法回补rSYNV-GFPΔsc4的运动。同样的,对于细胞质弹状病毒——TYMaV来说,仅其自身编码的P3可以回补rTYMaV-GFPΔP3的运动,表明弹状病毒胞间运动特异性地依赖于其自身编码的MP。蛋白互作分析表明,SYNV和TYMaV MP仅与自身N蛋白互作,而不与异源N蛋白互作,推测正是这种核衣壳蛋白与运动蛋白间的特异性互作导致异源病毒编码的MP无法回补弹状病毒胞间运动。进一步共表达试验发现,sc4能够帮助SYNVN-P复合体从核内复制位点定位到细胞周边类似PD的结构上,而不能互作的异源病毒MP则无法改变SYNVN-P复合体定位。这些结果表明,弹状病毒MP通过与核衣壳蛋白特异性互作,引导后者胞内和胞间运动。目前对于植物病毒长距离运动的认识主要基于正链RNA病毒的相关研究,而我们对于植物负链RNA包膜病毒长距离运动的方式和机制了解甚少。我们利用SYNV反向遗传学系统对病毒的结构蛋白融合荧光标签,并对SYNV侵染的本氏烟叶柄、茎秆和根部等维管组织进行徒手切片和超薄切片,通过共聚焦显微镜和透射电镜跟踪和观察病毒蛋白以及病毒粒子的组织定位。实验结果表明,SYNV可在韧皮部复制并进行长距离运输;完整的病毒粒子或结构蛋白存在于本氏烟韧皮部和木质部薄壁细胞、甚至木质部导管等组分中,但没有直接的证据表明SYNV完整病毒粒子可以通过植物木质部导管进行长距离运输。超侵染排阻是指初侵染病毒阻止相同的或将近的病毒对该细胞的再次侵染,是一种病毒之间的同源干扰(homologous interference),也被称为交叉保护(cross protection)。利用不同荧光标记的SYNV变体,发现SYNV在细胞水平和器官水平都存在明显的SIE现象,而与亲缘关系较远的PVX之间并没有SIE现象。瞬时表达SYNV M蛋白抑制SYNV侵染,而表达M mRNA则无抑制作用,表明SIE发生在M蛋白水平而不是RNA水平。相应地,SYNVM缺失突变体部分丧失了对同源病毒排阻的能力。进一步分析发现,SYNV M蛋白可以通过与N蛋白的互作抑制基因组复制与转录。MG126L突变体丧失了与SYNV N蛋白互作的能力后丧失了对SYNV转录和复制的抑制能力;同时M蛋白的NLS突变体无法与N蛋白在细胞核内发生强烈互作,也丧失了对SYNV转录和复制的抑制能力。这些结果表明,初次侵染的SYNV经复制后期大量表达的M蛋白通过与包裹基因组RNA的N蛋白互作,抑制病毒的基因组复制和转录,从而导致再次进入细胞的同源病毒无法复制和侵染。本文利用SYNV反向遗传学体系,深入研究了 SYNV的运动蛋白sc4的性质以及SYNV在胞内、胞间和长距离运动上的特性;发现了 SYNV存在的SIE现象,并揭示了 SYNV诱发SIE现象的背后机制。本论文研究结果有助于深入理解植物负链RNA病毒运动和侵染等分子机制,为该类病毒病害的防控提供理论支撑。
Abstract
zhi wu dan zhuang bing du (rhabdoviruses)shi yi lei ji yin zu wei fu lian RNAde nang mo bing du (envelopedviruses),an fan wei hai duo chong liang shi he jing ji zuo wu ,yin qi yan chong chan liang sun shi 。ku ju cai huang wang bing du (Sonchus yellow net virus,SYNV)zai fen lei shang shu yu dan zhuang bing du ke (Rhabdoviridae)xi bao he dan zhuang bing du shu (Nucleorkibabdovirus),shi mu qian yan jiu jiao wei shen ru de zhi wu dan zhuang bing du 。SYNVzai xi bao he nei fu zhi ,bing du li zi cong nei he mo (inner nuclear membrane)chu ya hou fu ji yu he zhou qiang (perinuclearspace)。qin ran zhi wu 、kun chong 、yu lei he ji chui dong wu deng bu tong ji zhu de dan zhuang bing du jun yi 3’-N-P-M-G-L-5’de shun xu bian ma wu ge bao shou de bing du jie gou dan bai ,ju zai ji yin zu fu zhi yu zhuai lu 、chu ya (budding)he bing du li zi xing cheng deng guo cheng ju you lei shi de te xing 。ci wai ,zhi wu dan zhuang bing du hai bian ma le yi ge e wai de fei jie gou dan bai ,ji zhi wu dan zhuang bing du kuo san qin ran suo bi xu de yun dong dan bai (movement protein,MP)。chang jiu yi lai you yu fan xiang wei chuan xue ti ji de que shi ,xue jie dui yu zhi wu dan zhuang bing du de yun dong ji zhi zhi zhi shen shao 。ben yan jiu yi shi yan shi gou jian de zhi wu dan zhuang bing du qin ran xing ke long wei ji chu ,yi SYNVwei chong dian yan jiu dui xiang ,tan suo le bing du bao jian yun dong he chang ju li yun dong mo shi ,yi ji chao qin ran pai zu (superinfectionexclusion,SIE)deng xian xiang de fen zi ji zhi 。wei le ming que SYNVbao jian yun dong fang shi ,wo men gou jian yi ji lie SYNVque shi tu bian ti ,bao gua fei jie gou dan bai sc4、bing du ji zhi dan bai (matrix protein,M)、tang dan bai (Glycoprotein,G)yi ji Mdan bai he Gdan bai shuang que shi tu bian ti ,bing fen xi le zhe xie que shi tu bian ti bing du de bao jian yun dong neng li 。yan jiu jie guo biao ming ,sc4wei SYNVde yun dong dan bai ,ji que shi dao zhi SYNVsang shi bao jian yun dong neng li ;M、Gyi ji Mhe Gshuang que shi tu bian ti yi ran ju you you xian de bao jian yun dong neng li ,cong er ming que le SYNVde zui xiao yun dong chan wei shi ji bing du he dan bai (nucleoprotein,N)、lin dan bai (phosphoprotein,P)he RNAju ge mei (Large polymerase,L)dan bai bao guo ji yin zu xing cheng de he yi ke (nucleocapsid,NC)。ya xi bao ding wei fen xi fa xian ,shun shi biao da de SYNVsc4dan bai zhu yao ding wei yu ben shi yan biao pi xi bao de xi bao zhou zhi (cell periphery),zai xi bao he nei ye you shao hu fen bu 。sc4he gao er ji ti marker ManI-mCherry、ER nei zhi wang de marker GFP-HDEL、xi bao gu jia wei guan marker MAP65-RFPyi ji xi bao gu jia wei si marker ABD2-GFPjun mei you xian zhe de gong ding wei 。li yong yi zhi dan bai fen bi ji tong he xi bao gu jia de yao wu jin hang chu li fa xian ,20μg/mlde bu lei fei de jun su A(Brefeldin A,BFA)ke yi tong guo po huai nei zhi wang wang qiang jie gou lai yi zhi SYNVbao jian yun dong ,er wei guan yi zhi ji an huang le ling (Oryzalin)he wei si jie ju ji la chun ku lin B(Latrunculin B,Lat B)ze dui SYNVbao jian yun dong mei you ying xiang 。yu SYNVN、Pdan bai yi yang ,sc4ye ju you ti wai fei te yi xing jie ge chan lian RNAde neng li 。BiFChe jiao mu shuang za jiao jun fa xian sc4yu zhu yao he yi ke dan bai Nhe Pdan bai cun zai hu zuo 。wo men li yong dan zhuang bing du SYNV、ma ling shu huang ai bing du (Potato yellow dwarf virus,PYDV)、shui dao huang ai bing du (Rice yellow stunt virus,RYSV)、shui dao tiao wen hua xie bing du (Rice yellow stunt virus,RSMV)he fan jia huang ban bo xiang guan bing du (Tomato yellow mottle-associated virus,TYMaV)bian ma de MP,fen bie cheng gong hui bu le fan jia hua xie bing du yun dong dan bai que shi tu bian ti (ToMV-GFPΔMP)he ma ling shu Xbing du yun dong dan bai que shi tu bian ti (PVX-GFPΔp25)de bao jian yun dong ,biao ming dan zhuang bing du de yun dong dan bai he zheng lian RNAbing du de yun dong dan bai you gong neng shang de xiang shi xing 。dui SYNVyun dong dan bai que shi tu bian ti (rSYNV-GFPΔsc4)jin hang fan shi hu bu shi yan fa xian ,chu le ji zi shen bian ma de sc4yun dong dan bai ,ji ta dan zhuang bing du ru PYDV、RYSV、RSMVhe TYMaVbian ma de MPyi ji huang gua hua xie bing du (Cucumbber mosaic virus,CMV)、yan cao hua xie bing du (Tobacco mosaic virus,TMV)、shui dao tiao wen bing du (Rice stripe virus,RSV)、fan jia ban wei bing du (Tomato spotted wilt virus,TSWV)、fan jia cong ai bing du (Tomato bushy stunt virus,TBSV)、fan jia hua xie bing du (Tomato mosaic virus,ToMV)bing du bian ma de MPdou mo fa hui bu rSYNV-GFPΔsc4de yun dong 。tong yang de ,dui yu xi bao zhi dan zhuang bing du ——TYMaVlai shui ,jin ji zi shen bian ma de P3ke yi hui bu rTYMaV-GFPΔP3de yun dong ,biao ming dan zhuang bing du bao jian yun dong te yi xing de yi lai yu ji zi shen bian ma de MP。dan bai hu zuo fen xi biao ming ,SYNVhe TYMaV MPjin yu zi shen Ndan bai hu zuo ,er bu yu yi yuan Ndan bai hu zuo ,tui ce zheng shi zhe chong he yi ke dan bai yu yun dong dan bai jian de te yi xing hu zuo dao zhi yi yuan bing du bian ma de MPmo fa hui bu dan zhuang bing du bao jian yun dong 。jin yi bu gong biao da shi yan fa xian ,sc4neng gou bang zhu SYNVN-Pfu ge ti cong he nei fu zhi wei dian ding wei dao xi bao zhou bian lei shi PDde jie gou shang ,er bu neng hu zuo de yi yuan bing du MPze mo fa gai bian SYNVN-Pfu ge ti ding wei 。zhe xie jie guo biao ming ,dan zhuang bing du MPtong guo yu he yi ke dan bai te yi xing hu zuo ,yin dao hou zhe bao nei he bao jian yun dong 。mu qian dui yu zhi wu bing du chang ju li yun dong de ren shi zhu yao ji yu zheng lian RNAbing du de xiang guan yan jiu ,er wo men dui yu zhi wu fu lian RNAbao mo bing du chang ju li yun dong de fang shi he ji zhi le jie shen shao 。wo men li yong SYNVfan xiang wei chuan xue ji tong dui bing du de jie gou dan bai rong ge ying guang biao qian ,bing dui SYNVqin ran de ben shi yan xie bing 、jing gan he gen bu deng wei guan zu zhi jin hang tu shou qie pian he chao bao qie pian ,tong guo gong ju jiao xian wei jing he tou she dian jing gen zong he guan cha bing du dan bai yi ji bing du li zi de zu zhi ding wei 。shi yan jie guo biao ming ,SYNVke zai ren pi bu fu zhi bing jin hang chang ju li yun shu ;wan zheng de bing du li zi huo jie gou dan bai cun zai yu ben shi yan ren pi bu he mu zhi bu bao bi xi bao 、shen zhi mu zhi bu dao guan deng zu fen zhong ,dan mei you zhi jie de zheng ju biao ming SYNVwan zheng bing du li zi ke yi tong guo zhi wu mu zhi bu dao guan jin hang chang ju li yun shu 。chao qin ran pai zu shi zhi chu qin ran bing du zu zhi xiang tong de huo jiang jin de bing du dui gai xi bao de zai ci qin ran ,shi yi chong bing du zhi jian de tong yuan gan rao (homologous interference),ye bei chen wei jiao cha bao hu (cross protection)。li yong bu tong ying guang biao ji de SYNVbian ti ,fa xian SYNVzai xi bao shui ping he qi guan shui ping dou cun zai ming xian de SIExian xiang ,er yu qin yuan guan ji jiao yuan de PVXzhi jian bing mei you SIExian xiang 。shun shi biao da SYNV Mdan bai yi zhi SYNVqin ran ,er biao da M mRNAze mo yi zhi zuo yong ,biao ming SIEfa sheng zai Mdan bai shui ping er bu shi RNAshui ping 。xiang ying de ,SYNVMque shi tu bian ti bu fen sang shi le dui tong yuan bing du pai zu de neng li 。jin yi bu fen xi fa xian ,SYNV Mdan bai ke yi tong guo yu Ndan bai de hu zuo yi zhi ji yin zu fu zhi yu zhuai lu 。MG126Ltu bian ti sang shi le yu SYNV Ndan bai hu zuo de neng li hou sang shi le dui SYNVzhuai lu he fu zhi de yi zhi neng li ;tong shi Mdan bai de NLStu bian ti mo fa yu Ndan bai zai xi bao he nei fa sheng jiang lie hu zuo ,ye sang shi le dui SYNVzhuai lu he fu zhi de yi zhi neng li 。zhe xie jie guo biao ming ,chu ci qin ran de SYNVjing fu zhi hou ji da liang biao da de Mdan bai tong guo yu bao guo ji yin zu RNAde Ndan bai hu zuo ,yi zhi bing du de ji yin zu fu zhi he zhuai lu ,cong er dao zhi zai ci jin ru xi bao de tong yuan bing du mo fa fu zhi he qin ran 。ben wen li yong SYNVfan xiang wei chuan xue ti ji ,shen ru yan jiu le SYNVde yun dong dan bai sc4de xing zhi yi ji SYNVzai bao nei 、bao jian he chang ju li yun dong shang de te xing ;fa xian le SYNVcun zai de SIExian xiang ,bing jie shi le SYNVyou fa SIExian xiang de bei hou ji zhi 。ben lun wen yan jiu jie guo you zhu yu shen ru li jie zhi wu fu lian RNAbing du yun dong he qin ran deng fen zi ji zhi ,wei gai lei bing du bing hai de fang kong di gong li lun zhi cheng 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自浙江大学的周昕，发表于刊物浙江大学2019-09-18论文，是一篇关于苦苣菜黄网弹状病毒论文,运动蛋白论文,胞间运动论文,长距离运动论文,超侵染排阻论文,浙江大学2019-09-18论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自浙江大学2019-09-18论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：苦苣菜黄网弹状病毒论文; 运动蛋白论文; 胞间运动论文; 长距离运动论文; 超侵染排阻论文; 浙江大学2019-09-18论文;