草鱼鱼鳞胶原蛋白的若干生物学性能研究

论文摘要

胶原蛋白是一种广泛存在于生物体中的结构蛋白。近年来,胶原蛋白在医学组织工程中作为生物材料的应用日益广泛。本研究以草鱼鱼鳞为原料,分别采用酸提取和酸-酶提取法制备草鱼鱼鳞酸溶性胶原蛋白（ASC）和酶溶性胶原蛋白（PSC）,在胶原蛋白高分子结构的表征基础上,系统研究了淡水鱼胶原包括溶液行为、凝胶形成与质构、体外酶降解性能以及胶原海绵的材料性能在内的主要生物学性能,并与哺乳动物来源的猪皮胶原蛋白（PC）相比较,为淡水鱼胶原蛋白在生物医学材料中的应用提供数据基础。在低温条件下,采用常规方法提取并分离纯化草鱼鱼鳞胶原蛋白ASC、PSC和猪皮胶原蛋白PC,通过红外光谱分析、SDS电泳分析,表明提取所得的三种胶原均是典型的Ⅰ型胶原并具有较高的纯度。氨基酸组成分析表明,胶原蛋白提取方法和胶原来源均可导致胶原蛋白在氨基酸组成上的差异。采用浊度试验的方法初步研究了ASC、PSC和PC胶原蛋白在溶液中的体外自组装行为。结果表明,在相同条件下,PC的自组装程度显著高于ASC和PSC。同时,胶原蛋白在溶液环境中的体外自组装行为受环境温度、体系pH、胶原浓度以及离子的影响。圆二色谱分析表明,胶原蛋白在溶液中的分子构象及行为受多种因素的影响。在相同条件下,PSC的圆二色信号值最大,其次为PC和ASC。热变性处理、接近蛋白等电点pH以及添加钙离子均可导致胶原的圆二色信号值减弱,说明这些因素均会影响胶原蛋白分子的溶液行为。采用圆二色谱的温度扫描模式分析了3种胶原蛋白的热变性过程,结果表明,在受热变性过程中,3种胶原均存在2个变性阶段,提示在胶原蛋白分子中存在2种热稳定性不同的结构域;ASC、PSC和PC起始变性温度分别为33℃、35℃和40℃。采用动态流变仪的粘弹模式研究了3种胶原蛋白的凝胶形成条件和凝胶粘弹性能,采用质构分析仪测定了其凝胶的质构性能及影响因素。实验表明,pH和蛋白浓度是影响胶原蛋白从溶液向溶胶（凝胶）转变的决定性因素。其中,3种胶原蛋白的转变临界点浓度均为5mg/mL,ASC的转变临界pH为4.5左右,而PSC和PC的转变临界pH为5左右。变温实验、形变率扫描实验、蠕变实验以及质构分析实验的结果均表明,ASC凝胶是一种硬度大、脆性高的凝胶,而PSC和PC凝胶是一种柔软且韧性好的凝胶。3种凝胶质构均受温度影响,升温处理可导致ASC凝胶结构的不可逆破坏,表现为弹性模量的持续下降;而对于PSC和PC凝胶,在低于变性温度的条件下,升高温度可以促进胶原分子的有序重排,从而提升其凝胶质构性能。3种胶原蛋白的体外酶降解实验结果表明,ASC、PSC和PC具有不同的酶敏感特性。在相同条件下,PC的降解速率最慢,其次为PSC和ASC。热变性处理会提高蛋白的酶敏感性,而酶降解前的蛋白自组装程序则正好相反。分别采用拉伸实验、比表面积测定和SEM观察的手段,初步评价了3种胶原海绵的材料性质。结果表明,淡水鱼来源的胶原海绵PSC和ASC是一种具有多孔结构但拉伸强度较弱的海绵材料,而哺乳动物来源的PC是一种拉伸强度较大但结构比较致密的海绵材料,提示这三种胶原海绵在生物医学材料中具有不同的应用领域。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 胶原蛋白的研究进展
• 1.1.1 胶原蛋白的简介
• 1.1.2 胶原蛋白的结构特点
• 1.2 组织工程概述
• 1.3 胶原蛋白在医学组织工程中的应用
• 1.4 淡水鱼胶原蛋白研究进展
• 1.5 立题背景意义
• 1.6 主要研究内容
• 1.6.1 总体研究思路
• 1.6.2 主要研究内容
• 第2章 胶原蛋白的分离纯化、结构鉴定及其溶液行为研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂与仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果与分析
• 2.2.1 氨基酸组成分析
• 2.2.2 傅立叶变换红外光谱分析
• 2.2.3 SDS-PAGE 分析
• 2.2.4 胶原蛋白的体外自组装观测
• 2.2.5 圆二色谱分析
• 2.3 小结
• 第3章 草鱼鱼鳞胶原蛋白的凝胶形成及其性能研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂与仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果与分析
• 3.2.1 凝胶形成条件
• 3.2.2 凝胶粘弹性能的测定
• 3.2.3 凝胶质构的测定
• 3.3 小结
• 第4章 草鱼鱼鳞胶原蛋白的体外降解性能研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂与仪器
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 实验结果与分析
• 4.2.1 胶原蛋白体外酶降解方法的建立及降解酶的选择
• 4.2.2 草鱼鱼鳞胶原ASC、PSC 和猪皮PC 体外酶降解性能的比较
• 4.2.3 热变性预处理对胶原体外降解性能的影响
• 4.2.4 自组装处理对胶原降解的影响
• 4.2.5 胶原浓度对酶降解效率的影响
• 4.3 小结
• 第5章 草鱼鱼鳞胶原蛋白海绵的的材料性能研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试剂与仪器
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 实验结果与分析
• 5.2.1 机械性能测试
• 5.2.2 比表面积测定
• 5.2.3 SEM 观察
• 5.3 小结
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果