真核生物翻译起始因子eIF5A溶液结构研究

论文摘要

真核生物翻译起始因子5A（eIF5A）是一个分子量约18 kDa的酸性蛋白,其序列从古细菌到哺乳动物高度保守,并广泛存在于各种真核生物细胞中。eIF5A是迄今为止唯一一种已知含有特殊氨基酸残基hypusine的蛋白质。hypusine是一种蛋白翻译后修饰产物,它的形成对eIF5A的功能完整至关重要,相关的研究结果表明hypsine在控制细胞周期循环的过程当中扮演着一个重要的角色。在过去30年对eIF5A进行的一系列研究中,人们发现eIF5A具有广泛的功能。尽管eIF5A可能参与诸多细胞生理过程,但其具体生物学功能及其hypusine修饰的生物学意义并不十分清楚。我们中心细胞生物学实验室进行的研究结果表明,eIF5A可能是p53的一个调控因子。而且进一步的研究发现,另一个含两个PDZ结构域的蛋白-syntenin可以通过影响eIF5A和p53的信号转导通路来调控p53的水平,从而影响细胞凋亡。为了研究eIF5A与syntenin以及其他蛋白之间的相互作用,进而获得更多eIF5A结构和功能之间的关系,我们利用核磁共振技术解析了人eIF5A的溶液结构并结合其结构特点对功能进行了初步探讨。我们首先克隆、表达和纯化了15N和15N/13C标记的人的eIF5A蛋白,并利用MADLI-TOF-MS等方法进行了鉴定。二维1 H- 15N HSQC核磁共振谱图结果显示eIF5A的蛋白状态适合于用核磁共振方法进行结构研究。之后,我们通过优化缓冲液中盐的浓度和pH值以及调整核磁共振实验温度等参数确定了三共振实验条件,并采集了一系列三维核磁共振谱图,包括用于主、侧链谱峰指认的HNCO、HNCA、HN（CO）CA、HNCBCA、CBCA（CO）NH、HBHA（CO）NH、HCC（CO）NH、CC（CO）NH、HCCH-COSY、HCCH-TOCSY等实验,以及用于收集距离约束的3D 15 N-编辑NOESY-HSQC和3D 13C-编辑NOESY-HSQC。然后,我们采用Cyana和Amber等软件通过一系列的结构计算和结构优化,最终解析了人eIF5A的溶液结构。此外,为了确定eIF5A两个结构域的相对取向,我们还测定了蛋白质的残余偶极耦合常数。在我们解析的人的eIF5A的溶液结构中,可以看到eIF5A由结构域Ⅰ和结构域Ⅱ组成,且每个结构域都由多个反平行的β-折叠片组成,这两个结构域通过一个活动的铰链连接而成整个蛋白的构象。此外,从结构上看,序列上hypusine所在的位置是一个突出的灵活的环,这个环连接了N端结构域上的两个β-折叠片。对已报道的古细菌eIF5A的晶体结构结构进行比对分析发现,这些三维结构和我们解析的结构具有非常相似的特征。但我们解析的人的eIF5A的溶液结构与其他同源结构相比有一个很重要的不同:即在人的eIF5A的溶液结构的结构域Ⅱ中,有两个β-折叠片是通过一个α-螺旋连接的,而在古细菌的蛋白中不含有α-螺旋。结构域Ⅱ中多样的残基序列,并且加上有一个在古细菌中没有的α-螺旋结构单元,这可能都反映了eIF5A在结构和功能上的进化。已有报道显示eIF5A独立的结构域Ⅱ能和syntenin反应,这也在一定程度上验证了eIF5A结构域Ⅱ的结构特点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写表
• 第一章 综述
• 第一节 核磁共振技术简介
• 第二节 核磁共振技术与蛋白质结构解析
• 1.2.1 核磁共振多维结构研究的主要特性参数
• 1.2.1.1 化学位移
• 1.2.1.2 核Overhauser 效应
• 1.2.2 蛋白质的表达纯化和样品制备
• 1.2.3 NMR 实验数据的收集和处理
• 1.2.3.1 多维NMR 实验的扩展及关系
• 1.2.3.2 常用的三维实验及磁化矢量传递方式
• 1.2.3.3 FID 信号的处理及化学位移的校准
• 1.2.3.4 核磁共振信号的化学位移归属
• 1.2.4 蛋白质溶液结构解析
• 1.2.4.1 结构约束条件
• 1.2.4.2 生物大分子溶液结构计算
• 1.2.4.2.1 初始结构的获得
• 1.2.4.2.2 溶液初始结构的循环优化
• 1.2.4.2.3 溶液结构的计算
• 1.2.4.2.4 最终溶液结构的优化计算
• 参考文献
• 第二章 eIF5A 功能研究介绍
• 第一节 引言
• 第二节 eIF5A 的蛋白序列特点
• 第三节 eIF5A 和翻译起始因子
• 第四节 eIF5A 和hypusination 生物学过程
• 第五节 eIF5A 的其它生物学功能
• 第六节 eIF5A 与临床疾病研究
• 2.6.1 eIF5A 和炎症治疗
• 2.6.2 eIF5A 和青光眼的临床治疗
• 第七节 小结
• 参考文献
• 第三章 eIF5A 溶液结构研究
• 第一节 研究目的
• 第二节 eIF5A 的表达、纯化与分离
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 eIF5A 质粒构建与基因克隆
• 3.2.3 eIF5A 的表达
• 3.2.4 eIF5A 的纯化
• 3.2.5 eIF5A 13 C/ 1 5N标记蛋白培养
• 3.2.6 eIF5A 核磁共振样品制备
• 3.2.6.1 eIF5A 1 5N同位素标记样品的制备
• 3.2.6.2 eIF5A 15 N/ 13 C同位素标记样品的制备
• 第三节 eIF5A 的性质分析
• 3.3.1 Superdex-75 分析eIF5A 聚集状态
• 3.3.2 超速离心鉴定eIF5A 的分子量
• 3.3.3 圆二色谱分析eIF5A 的二级结构成分
• 第四节 eIF5A 化学位移归属
• 3.4.1 核磁共振实验
• 3.4.2 eIF5A 化学位移指认
• 3.4.3 eIF5A 二级结构分析
• 第五节 eIF5A 溶液结构计算
• 3.5.1 初始结构计算
• 3.5.2 溶液结构优化
• 3.5.3 残余偶极耦合（RDC）实验
• 3.5.3.1 eIF5A RDC 实验样品制备
• 3.5.3.1.1 噬菌体介质实验样品制备
• 3.5.3.1.2 聚丙烯酰胺凝胶体系实验样品制备
• 3.5.3.2 eIF5A 残余偶极耦合实验结果
• 3.5.3.2.1 Jeff有效耦合常数（D）的计算
• 3.5.3.2.2 eIF5A 在常规溶液体系中J 值的计算
• 3.5.3.2.3 eIF5A 在796 Polyacrylamide Gel 体系中D+J 值的计算
• 3.5.3.2.4 eIF5A 在1596 Pf1 体系中D+J 值的计算
• 3.5.3.3 eIF5A RDC 实验结果讨论
• 第六节 实验结果讨论
• 3.6.1 eIF5A 同源结构分析
• 3.6.2 人eIF5A 结构分析
• 第七节 小结
• 参考文献
• 第四章 总结与展望
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 附录四
• 论文发表情况
• 致谢