玉米光周期敏感相关基因的克隆与分析

论文摘要

热带、亚热带玉米种质具有丰富的遗传变异,是拓宽我国玉米种质遗传基础和提升育种水平的一个重要途径。然而,玉米光周期敏感是热带、亚热带种质利用的一个主要障碍。因此,分离、克隆控制玉米光周期敏感相关基因并探知其功能,进而揭示光周期敏感的遗传特性和内在机制,不仅对热带、亚热带玉米种质的有效利用,而且对植物花发育生物学机理研究的深入,均具有重要的理论和实践意义。本研究以热带玉米光周期敏感自交系CML288为材料,通过长、短日照挪移试验,在明确玉米对光周期反应敏感指标和敏感时期的基础上,利用抑制差减杂交的方法,构建了具有3000多个单克隆的光周期敏感差减文库;利用同源基因克隆结合RACE技术,分离克隆了ZmHd1、PL5L15和PL3K2等同玉米光周期敏感反应相关的重要基因,并分析了克隆基因在不同发育时期和器官的表达特点;然后根据生物信息学分析,通过与RIL群体光周期敏感基因QTL定位研究结果的比较,初步对ZmHd1基因进行了定位和功能的验证。主要研究结果如下:1、通过对CML288和黄早四玉米自交系光周期敏感特性对比试验发现,在9小时短日照条件下,CML288和黄早四均发育正常,能够正常抽雄,节间伸长明显。15h长日照条件下CML288雄穗不能分化,节间短缩,对光周期反应敏感,黄早四抽雄略有推迟,节间伸长正常。说明CML288对光周期的敏感性明显强于黄早四,是一个对光周期敏感的热带玉米材料。通过CML288长、短日照处理相互挪移试验发现,从短日条件挪移到长日条件的植株,6叶期未见雄穗分化,7叶期、8叶期雄穗发育基本正常,9叶期雄穗发育正常,说明6～7叶期是光周期反应最敏感的时期,7～9叶期是光周期敏感的持续期,但敏感效应明显减弱。2、利用同源克隆和RACE技术,成功地分离克隆了ZmHd1的CDS序列、基因组DNA序列。CDS序列全长1310bp,具有1197bp完整的ORF阅读框,编码一条397个氨基酸残基的肽链,含有CO/Hd1家族基因2个保守的BBOX与CCT结构域,ZmHd1基因是由一个内含子与2个外显子构成,具有完整的编码区域和帽子结构、启动子和转录终止子等转录元件。玉米ZmHd1与水稻Hd1基因具有74%的序列同一性,编码的氨基酸序列具有75%的同源性,明显高于水稻与拟南芥的同源性。因此认为,玉米ZmHd1是水稻的光周期敏感基因Hd1的一个同源基因,可能是控制玉米光周期敏感反应的一个重要基因。3、黄早四与CML288 ZmHd1基因gDNA序列对比发现,在第二个外显子中发生一个从T向A的点突变,导致产生了一个翻译的终止密码子,而使具有CO/Hd1基因家族保守的CCT结构域蛋白翻译被提前终止,使C末端的核定位信号功能丧失。因此,ZmHd1基因蛋白编码区中一个核苷酸突变所产生的终止密码子,可能是光周期敏感性发生改变的一个重要机制,显示出在这个基因位点对光周期反应的敏感和钝感反应。根据黄早4在ORF之内这个早熟终止子序列,与CML288 ZmHd1序列中存在的这个核苷酸差异所产生的StuI的酶切位点,成功地开发了一个简单有效的CAPS标记,可用来测定2个玉米材料中光周期敏感基因的存在。4、ZmHd1基因序列与MaizeGDB数据库公布的B73测序的AC189064克隆序列同源性高达98～99%,由于玉米基因组测序已经基本结束,而在基因组测序的克隆中仅有一个拷贝同该基因具有这样高的同源性,因此推断该基因位于玉米第9染色体的9.03区段内,接近着丝点位置。通过RIL遗传作图群体的光周期敏感相关基因的QTLs定位分析,在这个区间检测到一个同光周期敏感反应有关的QTL,因此认为ZmHd1可能是这个光周期敏感主效QTL的一个侯选基因。Real-time PCR分析显示,ZmHd1基因进入光周期敏感时期具有上调表达的趋势,而且长日照条件的表达高于短日条件。5、以热带玉米光周期敏感时期的叶片与茎尖为材料,利用SSH技术构建了对长日照敏感而特异表达的基因文库,3000多个单克隆被有效地富集在正向光周期敏感差减文库中,为进一步分离克隆光周期敏感基因的研究搭建一个材料平台。对差减文库中分离的64个特异表达EST序列分析表明,16个EST序列与玉米已知编码的功能蛋白序列具有较高的同源性,可以初步推测其功能,可能的蛋白功能主要涉及光接受与信号转导、生长分化与发育转录因子、逆境反应等多个生理生化途径中的相关基因,31个序列与其它物种编码序列同源性较高,7个EST可能代表了新基因。6、以SSH文库的EST克隆为材料,利用同源克隆技术,成功分离克隆出了玉米PL5L15基因的cDNA序列。PL5L15基因cDNA全长1410bp,具有897bp完整的ORF阅读框,编码一条292个氨基酸残基的肽链,位于该肽链第89到272个氨基酸中含有一个保守的Clp-protease结构域。与ClpR2基因序列具有78%的同源性。因此,所克隆的PL5L15是玉米Clp蛋白酶家族的ClpR2-LIKE基因,初步推测该序列可能位于玉米第9条染色体上。Real-time PCR分析显示,在短日条件下该基因正常水平的表达促进了生殖分化,但在长日条件下持续过量高表达则抑制了生殖分化,推测可能与玉米光周期反应条件下的生殖分化有关。7、利用SSH文库的EST序列成功分离克隆出了玉米PL3K2基因的cDNA序列。序列全长639bp,具有453bp完整的阅读框,编码150个氨基酸残基的肽链,位于该肽链的第25到150个氨基酸中含有一个保守的Jacalin结构域,包含Jacalin功能域的蛋白属于Lectin基因家族成员。初步推测该序列可能位于玉米第10条染色体上。Real-time PCR分析显示,长日照逆境条件下该基因在茎尖中的表达显著高于短日照正常条件。该基因可能与玉米逆境抗性有关。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1 光周期促进植物开花的模式研究进展
• 1.1 光周期作用于花时的信号传导及形态发生研究
• 1.1.1 光周期作用于花时的信号传导
• 1.1.2 植物的光周期敏感时期研究
• 1.1.3 光周期作用于花时的形态发生研究
• 1.2 光受体的类别及功能
• 1.3 生物钟成分
• 1.4 拟南芥LD促进开花的光周期遗传途径和作用机理
• 1.5 CO基因的研究进展
• 2 水稻等其它单子叶植物的光周期敏感研究进展
• 3 玉米光周期敏感研究的进展
• 3.1 玉米种质光周期敏感遗传特性研究
• 3.1.1 不同生态类型的玉米种质对光周期的敏感程度不同。
• 3.1.2 不同的玉米群体对光周期的敏感程度不同。
• 3.1.3 玉米的不同性状对光周期敏感的程度及敏感指标
• 3.2 玉米光周期敏感相关性状的遗传特点及相关基因的定位研究
• 3.2.1 玉米光周期敏感相关性状的遗传特性研究
• 3.2.2 光周期敏感相关基因的定位研究
• 3.3 玉米光周期相关基因的克隆研究
• 4 基因克隆的方法
• 4.1 基于基因产物的基因克隆方法
• 4.1.1 蛋白质序列起始克隆法
• 4.1.2 蛋白质同功能互补克隆法
• 4.1.3 表达差异杂交克隆法
• 4.2 基于基因加标签的基因克隆方法-转座子标签技术
• 4.3 基于基因序列和基因图谱的基因克隆方法
• 4.3.1 基因序列同源克隆法
• 4.3.2 抑制性差减杂交克隆法
• 4.4 基于基因图谱的克隆方法
• 4.5 利用EST进行基因克隆的方法
• 4.5.1 EST电子杂交基因克隆
• 4.5.2 EST结合PCR技术克隆基因
• 5 实时定量表达研究技术及其引用
• 5.1 传统的定量PCR同实时定量PCR技术对比
• 5.2 技术原理
• 5.3 实时荧光定量PCR技术的分类
• 5.4 实时荧光定量PCR技术的应用
• 5.5 应用前景
• 6 玉米光周期敏感研究的意义
• 第二章 热带玉米种质CML288光周期敏感研究
• 1 材料及方法
• 1.1 材料与处理
• 1.2 取样与分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 长短日照互相挪移对雄穗发育的影响
• 2.2 长日对CML288雄穗分化及拔节的影响
• 3 结论与讨论
• 3.1 CML288是一个对光周期比较敏感的热带玉米材料
• 3.2 6到7叶期是CML288雄穗分化过程中接受光周期调控的最敏感时期
• 3.3 光周期长度、生殖分化同茎伸长具有一定的关系
• 第三章 玉米光周期敏感基因ZMHD1的克隆与表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料处理与取样
• 1.2 核酸处理
• 1.3 目的基因克隆
• 1.3.1 5'RACE法目的基因的CDS序列克隆
• 1.3.2 目的基因GDNA克隆
• 1.4 CDS序列及与基因组序列的比对分析
• 1.5 目的基因的实时定量表达分析
• 1.5.1 引物设计
• 1.5.2 标准品制备和标准曲线的建立
• 1.5.3 REAL-TIMEPCR的表达分析
• 1.5.4 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA提取、纯化及检测
• 2.2 目的基因的CDS序列克隆
• 2.2.1 玉米中HD1基因的同源序列验证
• 2.2.2 AY105193朝向5'端的延伸序列克隆
• 2.2.3 AY105193的5'端克隆
• 2.2.4 AY105193的5'RACE结果验证
• 2.2.5 AY105193的CDS全长克隆
• 2.3 目的基因的CDS序列分析
• 2.4 ZMHD1基因的GDNA序列克隆及分析
• 2.4.1 ZMHD1基因的gDNA序列克隆
• 2.4.2 ZMHD1的gDNA序列分析
• 2.5 ZMHD1基因的表达分析
• 2.5.1 cDNA检测
• 2.5.2 ZMHD1和18S的标准曲线
• 2.5.3 ZMHD1基因在发育各时期的表达结果
• 3.结论与讨论
• 3.1 玉米ZMHD1是水稻光周期敏感基因HD1的一个同源基因,可能也是控制玉米光周期敏感反应的一个重要基因
• 3.2 ZMHD1基因蛋白编码区中一个核苷酸突变所产生的终止密码子,可能是光周期敏感性发生改变的一个重要机制
• 3.3 推断ZMHD1基因应位于玉米第9染色体的9.03区段内,通过RIL遗传作图群体对其定位和初步推测其功能
• 3.4 开发能检测终止密码子或基因内功能的分子标记,通过检测该功能性基因的存在或缺失可以评价玉米品种的光周期敏感性
• 3.5 热带玉米CML288的ZMHD1基因进入光周期敏感时期具有上调表达的趋势,而且长日照条件的表达明显高于短日条件
• 图版:
• 第四章 玉米光周期敏感差减文库的构建与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料处理及取样
• 1.2 试剂
• 1.3 总RNA抽提及纯化
• +RNA分离'>1.4 POLYA⁺RNA分离
• 1.5 抑制差减杂交
• 1.5.1 cDNA第一链的合成
• 1.5.2 cDNA第二链的合成
• 1.5.3 RsaI酶切
• 1.5.4 接头的连接
• 1.5.5 第一轮杂交
• 1.5.6 第二轮杂交
• 1.5.7 PCR扩增差减杂交的产物
• 1.5.8 差减文库中特异表达EST的克隆
• 1.6 反向NORTHERN点杂交差异筛选cDNA文库
• 1.6.1 探针标记
• 1.6.2 质粒提取
• 1.6.3 制膜
• 1.6.4 杂交
• 1.6.5 显色
• 1.6.6 结果统计:
• 1.7 阳性克隆的测序和序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA抽提的质量检测
• 2.2 差减文库的效率分析
• 2.3 差减文库的构建与单克隆PCR检测
• 2.4 质粒提取检测
• 2.5 差示筛选结果
• 2.6 序列的处理及BLAST分析
• 3 结论与讨论
• 图版:
• 第五章 两个热带玉米长日诱导上调表达基因的克隆及分析
• 1、材料和方法
• 1.1 材料处理和取样
• 1.2 试剂
• 1.3 总RNA提取、纯化及反转录
• 1.4 目的基因PL5L15的克隆、分析
• 1.4.1 目的基因的克隆
• 1.4.2 目的基因的序列分析
• 1.4.3 Real-Time PCR表达分析
• 1.4.3.1 引物的设计
• 1.4.3.2 标准品制备和标准曲线的建立
• 1.4.3.3 Real-Time PCR的表达分析
• 1.5 目的基因PL3K2克隆的分析
• 1.5.1 目的基因克隆及生物信息学分析
• 1.5.2 目的基因的Real-Time表达分析
• 2、结果与分析
• 2.1 目的基因PL5L15的克隆及分析
• 2.1.1 目的基因的克隆
• 2.1.2 目的基因的结构分析
• 2.1.3 PL5L15的染色体位置分析
• 2.1.4 Real-TimePCR分析
• 2.2 目的基因PL3K2的克隆及分析
• 2.2.1 目的基因PL3K2的克隆
• 2.2.2 序列生物信息学分析
• 2.2.3 Real-Time PCR结果
• 3、结论与讨论
• 3.1 玉米PL5L15基因是拟南芥CLPR2的一个同源基因,可能与光周期反应条件下玉米生殖分化有关
• 3.2 PL5L15基因在短日条件下正常水平的表达促进了生殖分化,但在长日条件下持续过量高表达则抑制了生殖分化
• 3.3 玉米PL3K2是LECTINS家族的一个基因,在长日照逆境条件下该基因在茎尖中的表达显著高于短日照正常条件,可能与玉米逆境抗性有关
• 图版:
• 参考文献:
• ABSTRACT