杀蝗绿僵菌生物农药研制及其应用技术研究

论文摘要

我国是世界上蝗灾发生最为频繁的国家之一,其中东亚飞蝗是导致我国蝗灾发生的首要害虫。目前,我国蝗虫的主要控制手段是化学防治,化学农药大量长期施用已经造成蝗区严重的环境污染,使蝗区生态平衡受到破坏,蝗虫灾害的发生与治理进入恶性循环。使用与环境友好的生物农药替代化学农药成为今后控制蝗虫的重要发展方向。金龟子绿僵菌是一种昆虫病原真菌,具有安全、不杀伤非目标生物、害虫难以产生抗药性等优点,在蝗虫生物防治中起着重要作用。杀蝗绿僵菌生物农药作为国际蝗虫防治中最重要的可持续的生物防治手段,已被联合国粮农组织（FAO）推荐为环保产品推广应用。我国尚无登记注册的真菌杀虫剂农药。缺乏具有自主知识产权的杀蝗绿僵菌制剂是阻碍我国大规模应用绿僵菌制剂防治蝗虫的主要原因之一。真菌农药存在菌株选育困难、生产工艺研制滞后、缺乏质量控制体系等问题,这严重制约着杀虫真菌制剂的生产、研发和检测,目前国际上只有两个杀蝗绿僵菌生物农药登记注册。缺乏快速准确的毒力评价方法成为制剂研究的重要制约因素之一。昆虫病原真菌的入侵速度与在寄主体增殖是寄主昆虫罹病死亡的前提,其增殖数量及速率直接影响致病过程及杀虫效率。建立昆虫体内病原真菌的早期定量检测方法,能满足菌株选育、制剂研制以及制剂质量评价对杀虫剂毒力评价的需要,为我国杀虫真菌制剂的生产、研发和检测提供技术支持。本研究以分离于自然感染黄脊竹蝗Ceracris Kiangsu的金龟子绿僵菌CQMa102为实验菌株,主要内容包括:a)CQMa102的生物学特性研究;b)CQMa102的固体发酵参数优化;c)制剂技术研究与环境安全性评价;d)CQMa102杀蝗制剂田间应用技术研究;e)东亚飞蝗体内绿僵菌的荧光定量PCR检测体系的建立及应用。主要研究结果如下:1、通过与IMI330189非洲杀蝗菌株的生物活性、耐热性与抗紫外光线等生物学特性比较研究表明:CQMa102菌株对东亚飞蝗的生物活性高于IMI330189菌株,LT95提前1.3d;耐热性与抗紫外光线与对照菌株无显著差异。另外,CQMa102对蝗虫具有专化性。2、CQMa102菌株固体发酵优化培养基为:以大米为发酵物料,按1:0.3加入0.01-0.02%CuSO4、1%硝酸钠、1%微量元素混合液;培养条件为:发酵温度为25-28℃,初始pH值为5.5-6.5,发酵前期保持高湿、后期降湿,发酵周期12-15天。在优化培养基与培养条件下采用透气发酵袋发酵的产孢量比塑料发酵袋提高20%左右,平均达到19亿孢子/克。3、在选择色拉油为溶剂油的基础上添加3%的凡士林配制成稳定的100亿孢子/ml杀蝗绿僵菌油悬浮剂。常温贮存12个月孢子萌发率大于80%;能明显增加绿僵菌杀蝗生物活性。经原药与制剂的毒理学测评,绿僵菌孢子粉和100亿孢子/ml绿僵菌油悬浮剂属微毒类生物农药,对非目标生物友好。4、经过复配制剂兼容性筛选、增效实验确定含1%高效氯氰菊酯的100亿孢子/ml高氯?绿僵菌油悬浮剂,其共毒系数为263;喷施后第5天东亚飞蝗的死亡率达到90%以上,比100亿孢子/ml绿僵菌油悬浮剂处理组提前7-8d。与稀释液按1:4混合后施用,降低化学农药用量90%以上,减少对环境的非目标生物影响。5、真菌稀释液的最佳工艺参数:稀释液中混合乳化剂（HLB=4）、水与色拉油的重量百分比分别为1.5%、40%、58.5%。稀释液增效实验结果表明:稀释液缩短孢子萌发（90%以上）时间3小时以上;加快孢子侵入速度,点样接种后第4天,东亚飞蝗体液孢子平均浓度达2.41×107孢子/ml,为对照的约50倍;按2:1与杀蝗绿僵菌油悬浮剂混合后喷雾对东亚飞蝗的LT90提前1.44d。6、在多种生态环境中,100亿/ml杀蝗绿僵菌油悬浮剂与真菌农药稀释液按1:2混合后采用超低容量喷雾技术进行地面与飞机防治试验能有效控制3-4龄东亚飞蝗蝗蝻的种群数量;地面防治施药后9-15天防效达到90%以上,飞机防治施药后14-15d后残虫存活率<10%。7、根据绿僵菌28s rDNA的转录间隔区（ITS）和5.8S的基因序列,设计检测感病蝗虫体内绿僵菌菌体DNA分子的特异引物,通过优化感病蝗虫菌体DNA快速制备方法,建立了基于SYBR Green I的荧光定量PCR的定量检测体系。该检测方法专一、灵敏,检测下限为10 pg/μl绿僵菌,并且能从罹病36-48小时的东亚飞蝗血淋巴中早期定量检测到在虫体血淋巴中增殖的绿僵菌DNA。应用该技术研究稀释液增效作用进一步表明:稀释液的增效作用是通过加快绿僵菌穿透蝗虫表皮进入体内,使其在体内增值时间缩短实现的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 蝗灾严重威胁着农业生产
• 1.1.2 国内外蝗虫防治研究进展
• 1.1.3 绿僵菌研究进展
• 1.1.4 杀蝗绿僵菌生物农药的田间应用
• 1.1.5 FQ-PCR 技术的研究现状与在真菌检测中的应用
• 1.2 研究目的和意义
• 1.3 研究目标
• 1.4 研究内容和技术路线
• 1.4.1 绿僵菌CQMa102 菌株生物学特性研究
• 1.4.2 CQMa102 菌株孢子粉生产技术研究
• 1.4.3 杀蝗绿僵菌制剂技术研究
• 1.4.4 感病蝗虫体内绿僵菌定量检测研究及应用
• 1.5 本研究的创新性
• 2 材料和方法
• 2.1 金龟子绿僵菌 CQMa102 菌株生物学特性研究
• 2.1.1 试验菌株
• 2.1.2 供试昆虫
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要化学试剂
• 2.1.5 分生孢子的准备
• 2.1.6 CQMa102 菌株活性测试
• 2.1.7 菌株杀蝗谱测试
• 2.1.8 温度对CQMa102 生长的影响
• 2.1.9 初始pH 值对CQMa102 生长的影响
• 2.1.10 温度对孢子萌发的影响
• 2.1.11 紫外线对孢子萌发的影响
• 2.2 CQMa102 固态发酵研究
• 2.2.1 试验菌株
• 2.2.2 主要仪器设备
• 2.2.3 主要发酵原料与化学试剂
• 2.2.4 液体菌种的准备
• 2.2.5 固态发酵培养方法
• 2.2.6 孢子含水量测定方法
• 2.2.7 产孢量测定方法
• 2.2.8 金龟子绿僵CQMa102 发酵培养基的优化
• 2.2.9 温度对金龟子绿僵CQMa102 产孢的影响
• 2.2.10 光照对金龟子绿僵CQMa102 菌产孢的影响
• 2.2.11 初始pH 对金龟子绿僵CQMa102 产孢的影响
• 2.2.12 发酵过程培养物含水量的变化及其与产孢的关系
• 2.2.13 透气发酵袋对产孢的影响
• 2.3 杀蝗绿僵菌制剂技术研究
• 2.3.1 试验菌株
• 2.3.2 主要仪器设备
• 2.3.3 主要化学试剂
• 2.3.4 纯孢粉的制备
• 2.3.5 油悬浮剂研制及杀蝗效果
• 2.3.6 油孢子制剂研制及特性
• 2.3.7 杀蝗绿僵菌复配制剂的研究
• 2.3.8 真菌农药稀释液研制
• 2.4 杀蝗绿僵菌制剂及复配制剂对非目标生物影响
• 2.4.1 杀蝗绿僵菌制剂的准备
• 2.4.2 供试生物
• 2.4.3 杀蝗绿僵菌制剂非目标生物的影响
• 2.4.4 杀蝗绿僵菌复配制剂对非目标生物的影响
• 2.5 杀蝗绿僵菌田间应用技术研究与应用
• 2.5.1 杀蝗绿僵菌产品的准备
• 2.5.2 供试昆虫
• 2.5.3 主要试验药剂
• 2.5.4 主要设备
• 2.5.5 杀蝗绿僵菌田间防治东亚飞蝗应用技术研究与应用
• 2.5.6 杀蝗绿僵菌防治黄脊竹蝗野外应用试验
• 2.6 感病蝗虫体内绿僵菌定量检测研究
• 2.6.1 供试菌株与昆虫
• 2.6.2 主要化学与生化试剂
• 2.6.3 主要仪器
• 2.6.4 供试菌株培养及分生孢子悬浮液制备方法
• 2.6.5 东亚飞蝗血淋巴收集及处理
• 2.6.6 绿僵菌与蝗虫基因组DNA 制备
• 2.6.7 引物设计及特异性检测
• 2.6.8 标准曲线建立
• 2.6.9 蝗虫体内绿僵菌定量检测
• 2.6.10 定量PCR 在杀虫真菌制剂研究中的应用
• 3 结果与分析
• 3.1 金龟子绿僵菌 CQMa102 菌株生物学特性研究
• 3.1.1 菌株生物活性测试
• 3.1.2 CQMa102 菌株杀虫谱测试
• 3.1.3 温度对绿僵菌CQMa102 菌株生长的影响
• 3.1.4 初始pH 值对CQMa102 生长的影响
• 3.1.5 温度对孢子萌发的影响
• 3.1.6 紫外线孢子萌发的影响
• 3.2 CQMa102 菌株固态发酵研究
• 3.2.1 产孢促进剂 CuSO4 对 CQMa102 菌株产孢的影响
• 3.2.2 无机氮对CQMa102 菌株产孢的影响
• 3.2.3 微量元素对CQMa102 菌株产孢的影响
• 3.2.4 温度对CQMa102 菌株产孢的影响
• 3.2.5 光照对CQMa102 菌株产孢的影响
• 3.2.6 初始pH 对CQMa102 菌株产孢的影响
• 3.2.7 发酵过程培养物含水量的变化及其与产孢的关系
• 3.2.8 透气发酵袋对产孢的影响
• 3.3 杀蝗绿僵菌制剂技术研究
• 3.3.1 油悬浮剂研制及杀蝗效果
• 3.3.2 油孢子制剂及特性
• 3.3.3 杀蝗绿僵菌复配制剂的研究
• 3.3.4 真菌农药稀释液研制
• 3.4 杀蝗绿僵菌制剂及复配制剂对非目标生物影响
• 3.4.1 杀蝗绿僵菌制剂非目标生物的影响
• 3.4.2 杀蝗绿僵菌复配制剂对非目标生物的影响
• 3.5 杀蝗绿僵菌田间应用技术研究与应用
• 3.5.1 杀蝗绿僵菌田间防治东亚飞蝗应用技术研究与应用
• 3.5.2 杀蝗绿僵菌防治黄脊竹蝗野外应用试验
• 3.6 感病蝗虫体内绿僵菌定量检测研究
• 3.6.1 ITS 区的扩增
• 3.6.2 克隆检测
• 3.6.3 克隆测序结果
• 3.6.4 引物设计与退火温度优化
• 3.6.5 特异性检验
• 3.6.6 标准曲线建立及检测灵敏度
• 3.6.7 绿僵菌在蝗虫体内的增殖
• 3.6.8 真菌稀释液增效机制研究
• 4 讨论
• 4.1 金龟子绿僵菌 CQMa102 菌株生物学特性
• 4.2 绿僵菌 CQMa102 固态发酵
• 4.3 杀蝗绿僵菌制剂
• 4.3.1 油悬浮剂研制与评价
• 4.3.2 油孢子制剂
• 4.3.3 杀蝗绿僵菌复配制剂
• 4.3.4 真菌农药稀释液
• 4.4 杀蝗绿僵菌田间应用技术研究与应用
• 4.4.1 杀蝗绿僵菌田间防治东亚飞蝗应用技术研究与应用
• 4.4.2 杀蝗绿僵菌防治黄脊竹蝗野外应用试验
• 4.4.3 生态效应
• 4.5 感病蝗虫体内绿僵菌定量检测
• 4.5.1 定量PCR 检测与常规检测
• 4.5.2 水解探针与荧光染料
• 4.5.3 定量PCR 参照系的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A：绿僵菌ITS 区测序结果
• B：作者在攻读博士学位期间发表的论文目录
• C：作者在攻读博士学位期间已获授权国家发明专利