联苯降解菌Achromobacter sp. BP3的分离鉴定及降解基因的克隆

论文摘要

从长期石油污染土壤中分离筛选获得一株联苯降解细菌,经形态、生理生化特性测定及其16S rDNA系统进化分析,初步将该菌定为无色杆菌属（Achromobacter sp.）,将其命名为BP3（GenBank Accession No.EF057390）。菌株BP3能够在12h内降解完全50 mg·L-1的联苯,降解过程中有黄色开环产物2-羟基-6-氧-6-苯基己-2,4-二烯酸（HOPDA）累积。菌株BP3降解联苯的最适pH值为7.0～9.0,最适温度为35℃,降解联苯的速率和起始接种量呈正相关,在浓度为3～50mg·L-1范围内,联苯能迅速降解。Zn2+、Al3+、Fe2+对BP3降解联苯没有显著影响,Mn2+有一定的抑制作用,Cu2+、Ni2+、Cd2+有明显抑制作用。通过构建表达文库,获得6个2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因的阳性克隆,经过测序、在线ORF分析,推断出三个2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因（bphC,bphC2及xylE）。bphC2及xylE推测的氨基酸序列分别与2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶及儿茶酚2,3-双加氧酶最高相似性达100%,而bphC与已报道的2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶最高相似性为49%。根据基因序列分析结果设计特异性引物,并将其构建到表达载体pET29a中,在E.coli BL21（DE3）中进行了功能表达。进一步序列分析表明,bphC2及xylE分别位于联苯降解（bph）及间二甲苯降解（xyl）操纵子上。经过普通PCR扩增及染色体步移（chromosome walking）,获得了16.7kb的DNA片段,该片段包含完整的bph基因簇（bphRA1A2XA3A4BC2HJID）,并且在bph上下游分别检测到了与序列移动相关的整合酶基因及转座子部分序列,结合相关文献报道推测bph基因簇可能位于一个大的移动元件（mobile genetic element,MGE）上。获得了部分xyl基因簇（xylZLTEG）,其基因组织结构与已报道的xyl操纵子（xylXYZLTEGFJQKIH）相符。初步推测在菌株BP3中,bph基因簇负责联苯降解过程中上游途径及部分下游途径,而xyl基因簇参与联苯下游途径中苯甲酸的进一步降解。而bphC基因在菌株BP3降解联苯过程中扮演着怎样的角色,还需进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 文献综述
• 第一章 芳香烃类化合物的污染及其生物降解
• 1.芳香烃类化合物的污染
• 1.1 芳香烃的来源
• 1.2 芳香烃的危害
• 2.芳香烃生物降解
• 2.1 芳香烃生物降解途径
• 2.2 芳香烃降解中的氧化酶
• 第二章 联苯生物降解研究进展
• 1.联苯概述
• 2.联苯的微生物降解
• 2.1 降解途径
• 2.2 基因组织结构
• 2.3 联苯2,3-双加氧酶（羟基化双加氧酶）
• 实验部分
• 第三章 一株联苯降解菌的筛选、鉴定及其降解特性研究
• 1.材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 联苯降解菌的分离
• 1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定
• 1.4 降解菌株的16S rDNA序列的测定和鉴定
• 1.5 降解菌株系统发育地位的确定
• 1.6 联苯含量的测定
• 2.结果与分析
• 2.1 石油污染土壤中联苯降解菌株的分离
• 2.2 降解菌株BP3的形态特征、生理生化特征及其鉴定
• 2.3 菌株BP3对抗生素的耐受性
• 2.4 菌株BP3的降解特性研究
• 3.小结
• 第四章 2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶基因的克隆及表达
• 1.材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 菌体基因组DNA的提取,质粒DNA的提取
• 1.4 染色体DNA的部分酶切与酶切片段的回收
• 1.5 酶连及酶连产物的转化
• 1.6 阳性克隆的筛选
• 1.7 核苷酸序列的测定与序列分析
• 1.8 2,3-DHBP双加氧酶基因的PCR扩增及及高效表达载体的构建
• 1.9 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
• 1.10 酶活分析
• 2.结果与分析
• 2.1 菌株BP3的基因组DNA的部分酶切
• 2.2 基因组文库的构建及文库质量的检验
• 2.3 阳性克隆的筛选
• 2.4 阳性克隆的功能验证
• 2.5 序列测定及分析
• 2.6 DHBPDO基因的扩增及其在E.coli BL21（DE3）中的表达
• 2.7 菌株BP3中DHBPDO编码基因的比较分析
• 3.小结
• 第五章 联苯降解操纵子的克隆及联苯降解途径的推测
• 1.材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 菌体基因组DNA和质粒DNA的提取
• 1.4 PCR扩增引物
• 1.5 PCR产物的TA克隆
• 1.6 序列分析
• 2.结果与分析
• 2.1 bph及xyl基因簇序列分析
• 2.2 菌株BP3联苯降解途径
• 3.小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录一 文中所用培养基及试剂配方
• 附录二 攻读硕士学位期间发表或已录用的论文
• 致谢