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小分子人源抗体模拟谷胱甘肽过氧化物酶的研究

2020-12-07阅读(328)

小分子人源抗体模拟谷胱甘肽过氧化物酶的研究

论文摘要

谷胱甘肽过氧化物酶是哺乳动物抗氧化酶体系中的一个重要成员。它的主要功能是清除过氧化氢和脂质过氧化物、维持细胞正常氧化还原状态、保护脂质膜等其他细胞组分免受氧化损伤等,是治疗和预防多种疾病的潜在药物。但由于天然GPX来源有限、稳定性较差、分子量较大等缺点,限制了它在疾病治疗方面的应用。对GPX进行人工模拟不仅可以制备出更多潜在的抗氧化药物,还有利于对GPX催化机制的研究。为获得更多高活性,低分子量的人源GPX抗体酶,并进行初步的结构研究,我们主要进行了如下工作:1.与理论化学计算国家重点实验室合作,对已有人源单链抗体B3进行结构预测,分析含硒单链抗体酶Se-scFv-B3活性较低的原因,并利用定点突变的方法提高人源单链抗体酶Se-scFv-B3的活性,初步确定其底物结合部位。2.利用噬菌体展示抗体库技术获得一株新的、抗GSH的人源单链抗体2D8,并在原核表达系统中成功地实现其可溶性表达,经化学突变引入Sec后,获得具有较高GPX活性的含硒单链抗体酶Se-scFv-2D8;在与理论化学计算国家重点实验室合作对scFv-2D8进行结构预测及分析的基础上,利用定点突变等实验方法确定含硒单链抗体酶的主要催化基团,为后续基因工程法制备含硒单链抗体酶奠定基础。3.首次利用半胱氨酸营养缺陷型表达系统制备含硒人源单链抗体,虽然其GPX活性很低,但是结合理论分析得到结论:利用半胱氨酸缺陷系统进行含硒抗体酶的制备时,要充分考虑蛋白质本身的性质,除了催化基团之外本身含有Cys尤其是二硫键的蛋白质可能并不适合用该方法制备,或者需要对催化基团进行重新考察。4.制备单链抗体2D8的重链可变区片段,经化学修饰具有一定的GPX活性,首次获得分子量仅为单链抗体一半的人源单域抗体酶,为进一步制备小分子高活性的人源GPX模拟物奠定了基础。

论文目录

  • 提要
  • 第1章 绪论
  • 1.1 谷胱甘肽过氧化物酶
  • 1.1.1 GPX的分类
  • 1.1.2 GPX的结构
  • 1.1.3 GPX的催化机理
  • 1.1.4 GPX的生物学效应
  • 1.2 谷胱甘肽过氧化物酶的人工模拟
  • 1.2.1 酶模拟概述
  • 1.2.2 GPX人工模拟的研究进展
  • 1.3 酶分子的设计和改造
  • 1.3.1 酶的结构与催化活性
  • 1.3.2 结构测定的主要方法
  • 1.3.3 蛋白质结构预测
  • 1.3.4 分子三维结构的理论计算
  • 1.4 本论文的立论依据
  • 1.5 参考文献
  • 第2章 基于结构分析的定点突变提高含硒人源单链抗体的GPX活性
  • 2.1 序言
  • 2.2 对人源抗GSH单链抗体B3 结构的理论预测
  • 2.2.1 理论方法
  • 2.2.2 结果和讨论
  • 2.3 人源抗GSH单链抗体scFv-B3 及两个突变体scFv-B3-A180S和scFv-B3-A445的制备
  • 2.3.1 实验材料
  • 2.3.2 实验方法
  • 2.3.3 结果和讨论
  • 2.4 人源含硒单链抗体的制备和GPX活性测定
  • 2.4.1 实验材料
  • 2.4.2 实验方法
  • 2.4.3 结果和讨论
  • 2.5 本章小结
  • 2.6 参考文献
  • 第3章 人源含硒单链抗体Se-scFv-2D8 的制备和催化位点的研究
  • 3.1 序言
  • 3.2 抗GSH单链抗体的第四轮筛选
  • 3.2.1 实验材料
  • 3.2.2 实验方法
  • 3.2.3 结果和讨论
  • 3.3 人源单链抗体2D8 的表达与纯化
  • 3.3.1 实验材料
  • 3.3.2 实验方法
  • 3.3.3 结果和讨论
  • 3.4 人源含硒单链抗体Se-scFv-2D8 的制备和GPX活性测定
  • 3.4.1 实验材料
  • 3.4.2 实验方法
  • 3.4.3 结果和讨论
  • 3.5 对scFv-2D8 结构的理论预测和潜在活性位点的分析
  • 3.5.1 理论方法
  • 3.5.2 结果和讨论
  • 3.6 Se-scFv-2D8 催化基团的实验研究
  • 3.6.1 实验材料
  • 3.6.2 实验方法
  • 3.6.3 结果和讨论
  • 3.7 本章小结
  • 3.8 参考文献
  • 第4章 基因工程法制备含硒单链抗体的探讨
  • 4.1 序言
  • 4.2 硒代人源抗GSH单链抗体表达载体的构建
  • 4.2.1 实验材料
  • 4.2.2 实验方法
  • 4.2.3 结果和讨论
  • 4.3 含硒人源单链抗体及其突变体的基因工程法制备和活性测定
  • 4.3.1 实验材料
  • 4.3.2 实验方法
  • 4.3.3 结果和讨论
  • 4.4 硒代人源单链抗体2D8 的结构预测
  • 4.4.1 理论方法
  • 4.4.2 实验结果与讨论
  • 4.5 本章小结
  • 4.6 参考文献
  • H）模拟谷胱甘肽过氧化物酶'>第5章 含硒单域抗体（VH）模拟谷胱甘肽过氧化物酶
  • 5.1 序言
  • H的制备'>5.2 单域抗体2D8-VH的制备
  • 5.2.1 实验材料
  • 5.2.2 实验方法
  • 5.2.3 结果和讨论
  • H的制备和GPX活性测定'>5.3 人源含硒单域抗体Se-2D8-VH的制备和GPX活性测定
  • 5.3.1 实验材料
  • 5.3.2 实验方法
  • 5.3.3 结果和讨论
  • 5.4 本章小结
  • 5.5 参考文献
  • 攻读博士期间的科研成果
  • 致谢
  • 中文摘要
  • ABSTRACT

    • 相关论文文献

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