论文摘要
目的:肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病之一,中药治疗肿瘤有特殊的优势。本实验重点研究了赤芍有效成分-赤芍总苷（Total glucosides of Radix Paeoniae Rubra ,TGC）抗肿瘤作用及其机理。方法:本课题的主要研究内容包括:①复制小鼠S180和H22皮下移植模型,进行S180、H22整体动物实验,细胞培养人红白血病瘤株K562、Hela人宫颈癌、A549肺癌、Bel-7402肝癌、HCT-8结肠癌进行体外实验,筛选TGC敏感的细胞株;②取对数生长期的K562细胞,MTT显色法检测不同浓度不同时间赤芍总苷对K562细胞增殖的抑制作用,选定TGC作用24小时,TGC四个浓度0、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml进行促进细胞凋亡机理的研究;③取50只健康雄性KM小鼠,随机分5组,分别为正常组,模型组,环磷酰胺（CY）组,赤芍总苷（TGC）组,环磷酰胺+赤芍总苷（CY+TGC）组。复制小鼠S180皮下移植模型后,第2天进行治疗,连续给药7天,第8天处死,取血清、肿瘤组织。结果:通过以上实验得到下列结果:1.TGC对S180肿瘤组织有明显的抗瘤作用,抑瘤率高于H22肿瘤细胞可达42.81%。细胞周期测定,赤芍总苷对S180比H22更有效,S180凋亡细胞较多,肿瘤细胞阻滞在S期,细胞不再分裂增殖。MTT实验结果显示TGC对K562作用最好,抑制率最高,在50μg/ml的浓度就开始起作用,抑制率达45.9%。经计算IC50后比较敏感性,人红白血病瘤株K562>Hela人宫颈癌>A549肺癌>Bel-7402肝癌>HCT-8结肠癌。2.赤芍总苷对K562细胞生长的抑制作用具有量效-时效关系。选定TGC浓度为25、50、100μg/ml,作用24小时进行以下的研究条件。瑞-姬氏染色观察K562细胞中药干预后形态学发生改变,细胞周期显示G0/G1期细胞阻滞,凋亡峰明显出现,凋亡率增高。机理研究发现,赤芍总苷促使K562细胞磷脂酰丝氨酸膜外翻,Ca2+内流,线粒体膜电位MMP下降。通过实时定量PCR和WB,结果显示细胞色素C含量增加,caspase-3 mRNA,caspase-9 mRNA扩增明显,caspase-8 mRNA没有显著变化。赤芍总苷还可以调节基因蛋白表达,下调Bcl-2、Bcl-Xl,上调Bax,影响K562细胞凋亡。3.通过抑瘤率、形态指标、细胞周期观察,赤芍总苷抑瘤作用,并影响小鼠S180肿瘤组织内凋亡相关蛋白P16、Bcl-2、Bax和c-myc mRNA的表达,其中Bcl-2蛋白、c-myc mRNA表达量降低,Bax、P16蛋白表达量升高。4.赤芍总苷影响小鼠S180肿瘤细胞免疫逃避机制,抑制TGF-β1分泌,上调MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表达。而且也可以上调MHC-ⅠmRNA。结论:通过统计学分析及各指标间关系的深入探讨,研究结论如下:1.通过形态学、MTT、细胞周期等体内和体外大量实验表明,赤芍总苷对小鼠S180和K562肿瘤细胞有显著抗肿瘤作用。2.体外实验表明,赤芍总苷促使K562细胞凋亡机制是经过非受体依赖途径把信号传导到细胞内部,早期引起磷脂酰丝氨酸膜外翻,钙超载,线粒体跨膜电位（△ψm）下降。Ca2+都可诱发线粒体通透性转运孔开放,其结果是线粒体外膜破裂,线粒体跨膜电位（△ψm）下降或消失,继之呼吸链脱偶联,谷胱甘肽耗竭,活性氧类（reactiveoxygen species,ROS）产生及对诱导凋亡非常重要的蛋白酶活化物的释放。细胞色素C释放,进而依次激活caspase-9、caspase-3,引起DNA修复酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）是的降解,最终引起细胞核DNA片段化等一系列凋亡反应。当细胞受到死亡信号刺激,抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-Xl表达减少,而促凋亡基因Bax蛋白表达增加,与Bcl-2或Bcl-Xl蛋白相结合的Bax蛋白就会被置换出来,线粒体膜通透性增加,释放出一系列物质,最终导致细胞死亡。3.S180肿瘤组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、P16以及c-myc的表达,Bcl-2蛋白可通过拮抗野生型p53蛋白的凋亡而抑制多种因素诱发的细胞凋亡,参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控。Bax将重新定位于线粒体表面并破坏在正常状态下抗凋亡的Bcl-2蛋白的功能,Bax蛋白与Bcl-2蛋白的比值影响着细胞受到刺激后发生凋亡的比率,Bcl-2蛋白表达量降低,Bax蛋白表达量升高,协同诱导肿瘤细胞发生凋亡,增强抗肿瘤作用。在某种程度上,c-myc基因的转录水平反映着组织、细胞的增殖状态。c-myc诱导CyclinD高表达,共同影响细胞周期,促进细胞G1/S时相转换。赤芍总苷增高抑癌基因P16表达,下调c-myc表达,主要是抑制肿瘤细胞的增殖。4.赤芍总苷影响小鼠S180肿瘤细胞免疫逃避机制,抑制TGF-β1的分泌,上调MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表达。而且也可以上调MHC-ⅠmRNA,从而揭示TGC可通过肿瘤细胞表面免疫分子的表达,增强特异性细胞的抗肿瘤免疫应答功能,可抑制肿瘤细胞在体内转移和复发的重要措施。
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