论文摘要
乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE，EC3．1．1．7．）是昆虫神经传导中的一种关键酶，在胆碱能神经突触间，通过催化神经递质乙酰胆碱（acetylcholine，ATCh）来维持神经冲动的正常传递。AChE是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。由于杀虫剂的大规模长期的使用，不仅带来巨大的环境污染，而且导致许多种昆虫对杀虫剂产生了抗性，因此研究靶标酶与杀虫剂的互作，通过突变蛋白来筛选杀虫剂已经成为一项很重要的工程。家蝇乙酰胆碱酯酶被认为是检测杀虫剂最敏感的一类酶，传统的方法利用直接从家蝇头部提取的粗酶液作为酶源，但是这种方法却存在着一定的局限性，粗酶中含有许多干扰性的蛋白，使酶的敏感性下降，直接影响了检测的效率。本研究以家蝇乙酰胆碱酯酶作为研究对象，通过设计特异性的引物，扩增得到家蝇的敏感和抗性ace基因，同时将抗性基因的1224位碱基突变，并将这三个基因分别构建真核表达载体，转入昆虫细胞进行了表达研究，通过大量表达纯化敏感型的酶应用于对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的检测。主要研究结果如下：1．将家蝇敏感品系和抗性品系分别命名为SS，RR，克隆了敏感家蝇和抗性家蝇的乙酰胆碱酯酶基因，通过测序证明是正确的，利用体外定点突变技术将抗性家蝇品系的1224位碱基（即F408Y处）由A突变成T，相应的编码的氨基酸由酪氨酸变成苯丙氨酸。2．将SS，RR和V261L/G343A/D421V分别构建真核表达载体，利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，在昆虫细胞中表达，表达的酶经过SDS-PAGE分析，在上清中66kDa左右有一条特异性条带，而在细胞中却几乎没有，这也说明基因的信号肽可以将表达蛋白分泌到胞外。将表达的酶经过亲和层析柱后检验在66kDa处有单一的条带，也进一步证明了这就是我们的目的蛋白。有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对3种重组AChE的抑制中浓度(IC50)测定显示V261L/G343A/D421V突变组合AChE对不同杀虫剂的敏感度介于抗性组合V261L/G343A/F408Y/D421V和敏感AChE之间，但与抗性品系的敏感性相近而与敏感品系却相差很远。3．利用转染的SS品系的病毒上清进一步大批量感染Tn细胞，利用亲和层析的方法，纯化了该蛋白。利用纯化蛋白检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，结果表明，该酶对氨基甲酸酯类杀虫剂的敏感性要高于有机磷类，而最敏感的还是敌敌畏。同时，我们又检测了纯化的酶的抑制中浓度和能检测到的杀虫剂的最低限量，并与2005年公布的《食品中农药最大残留限量》国家标准进行比较，得出该酶对氨基甲酸酯类杀虫剂的敏感性要优于有机磷类，但是对部分农药最低检出值还有待改进。