H5N1流感病毒感染雏鸭免疫器官TGF-β1mRNA表达与免疫功能抑制

论文摘要

禽流感（avian influenza, AI）是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征,全球范围内不断有高致病性禽流感的爆发和流行,不但给养殖业造成了巨大的经济损失,尤其是近年来AIV感染给人类健康和生命安全构成了巨大威胁。水禽是禽流感病毒的巨大储存库,哺乳动物和鸡源流感病毒,均可从水禽（主要是鸭）体内分离到,可见鸭在禽流感病毒传播和变异过程中具有特殊作用。因此,本项研究对雏鸭感染禽流感病毒后,其免疫器官（胸腺、脾脏、法氏囊）的组织病理学损伤及免疫器官淋巴细胞凋亡和免疫抑制因子TGF-β1mRNA表达的动态变化了进行研究,旨在揭示禽流感病毒感染对雏鸭免疫器官免疫功能的抑制及其机制,为流感防制、疫苗研制及基因治疗等提供重要的实验依据。研究发现:1.H5N1亚型AIV感染雏鸭后,机体免疫器官受到不同程度的损伤,尤其在感染后35天损伤程度最为明显,免疫器官损伤可能是导致机体在感染初期免疫功能下降的重要原因。2.H5N1亚型AIV感染雏鸭后,其胸腺、法氏囊和脾脏凋亡细胞于感染后121天均不同程度地多于对照雏鸭;胸腺和法氏囊凋亡细胞数量在AIV感染后35天较对照雏鸭明显;脾脏凋亡细胞数量在AIV感染后15天较对照雏鸭明显增加。组织病理学检查可见,AIV感染雏鸭胸腺、法氏囊和脾脏内发生凋亡的细胞主要为淋巴细胞。表明AIV感染雏鸭胸腺、法氏囊和脾脏淋巴细胞发生显著凋亡是导致机体免疫抑制的主要因素。3.H5N1亚型AIV感染雏鸭24h后,其胸腺、法氏囊和脾脏TGF-β1mRNA表达均显著高于对照雏鸭,并持续到感染后第7天,之后TGF-β1mRNA表达回落到对照雏鸭水平。表明雏鸭感染H5N1亚型AIV引起强效免疫抑制因子TGF-β1显著增加,进而抑制T淋巴细胞增殖,降低CD8+T细胞杀伤活性,是H5N1亚型AIV导致感染雏鸭免疫功能下降,呈现免疫抑制的主要原因。另外,本项研究首次对鸭TGF-β1mature基因成功进行了克隆（GenBank登入号为EU661773）,经核苷酸和氨基酸同源性比较发现,鸭TGF-β1mature无论在核苷酸水平,还是氨基酸水平上与鸡TGF-β1mature都有高度的同源性,分别为93.6%,94.2%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 禽流感研究进展
• 1.1.1 禽流感病原学
• 1.1.2 禽流感病毒感染动物的病理学变化
• 1.1.3 禽流感病毒感染引发机体免疫反应机制
• 1.2 禽流感与细胞凋亡
• 1.2.1 细胞凋亡
• 1.2.2 病毒感染调控细胞凋亡机制
• 1.2.3 禽流感病毒与细胞凋亡
• 1.3 禽流感与 TGF-β1
• 1.3.1 TGF-β1 概述
• 1.3.2 TGF-β1 的免疫抑制作用
• 1.3.3 禽流感与TGF-β1
• 1.4 项目的研究目的与意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病毒
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要化学试剂及生物制剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验设计及动物处理
• 2.2.2 被检材料采取
• 2.2.3 检测指标及方法
• 2.3 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 H5N1 亚型AIV 感染雏鸭组织器官的病理学变化
• 3.1.1 雏鸭感染H5N1 亚型AIV 后器官组织的眼观病理变化
• 3.1.2 雏鸭感染H5N1 亚型AIV 后免疫器官组织病理学变化
• 3.2 H5N1 亚型AIV 感染雏鸭免疫器官凋亡细胞数量的动态变化
• 3.3 鸭TGF-Β1MATURE 基因分子克隆及序列分析
• 3.3.1 总RNA 提取
• 3.3.2 RT-PCR 扩增结果
• 3.3.3 重组克隆载体pMD18-T/P1 酶切鉴定
• 3.3.4 重组克隆载体pMD18-T/P1 质粒测序结果
• 3.3.5 鸭TGF-β1mature 基因核苷酸和氨基酸序列分析
• 3.4 REAL TIME PCR 检测TGF-Β1 MRNA 表达的构建
• 3.4.1 TGF-β1mature P2 和β-actin RT-PCR 电泳结果
• 3.4.2 重组质粒pMD18-T/P2 和pMD18-T/β-actin 酶切鉴定
• 3.4.3 重组质粒pMD18-T/P2 和pMD18-T/β-actin 序列测定
• 3.4.4 Real Time PCR 重组质粒pMD18-T/P2 标准品扩增曲线、熔解曲线及标准曲线
• 3.4.5 Real Time PCR 重组质粒pMD18-T/β-actin 标准品扩增曲线、熔解曲线及标准曲线
• 3.4.6 Real Time PCR检测鸭免疫器官TGF-β1mature P2基因扩增曲线和熔解曲线
• 3.4.7 Real Time PCR 检测鸭免疫器官β-actin 基因扩增曲线和熔解曲线
• 3.5 H5N1 亚型AIV 感染雏鸭免疫器官TGF-Β1 MRNA 表达的动态变化
• 4 讨论
• 4.1 鸭 TGF-β1 mature 基因克隆
• 4.2 H5N1 亚型AIV 感染雏鸭免疫器官损伤与免疫抑制
• 4.3 H5N1 亚型 AIV 感染对雏鸭免疫器官 TGF-β1mRNA 表达的影响与免疫抑制
• 4.3.1 H5N1 亚型AIV 感染对雏鸭免疫器官TGF-β1mRNA 表达的影响
• 4.3.2 H5N1 亚型AIV 感染雏鸭免疫器官TGF-β1mRNA 表达与免疫抑制
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文