授粉后黄瓜果实膨大生长相关基因的克隆与表达分析

论文摘要

果实发育包括果实细胞分裂生长期（子房发育期）、果实膨大生长期和果实成熟期三个阶段。自然条件下，非单性结实植物的子房只有授粉受精后才能座果，进入果实膨大生长期，否则衰老脱落。大量研究表明，激素参与了果实的早期发育，并在座果和果实膨大生长过程中发挥了重要作用。外源生长素类或赤霉素类植物生长调节剂可以并已广泛用于人工诱导未授粉或未受精子房发育成果实。利用分子生物学手段通过对天然的和激素诱导的单性结实研究，迄今已克隆到少量与果实膨大生长相关基因。但是，究竟是哪些基因启动或参与了果实膨大生长，至今尚不明了，还需要做大量的研究。 黄瓜（Cucumis sativus L．）子房下位，个体大，生长快，是研究果实发育的好材料。本研究以非单性结实的全雌黄瓜材料为研究对象，利用cDNA-AFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism）技术显示开花后未经授粉0h黄瓜子房和授粉后6～72h这段时间的黄瓜幼果的基因表达差异，获得64条差示带：经反向Northern斑点杂交验证，其中5条主要在授粉后黄瓜幼果中特异表达，包括一条属于编码扩张蛋白的新基因Cs-Expansin 10（CsEXP10）。鉴于扩张蛋白在植物发育中的作用，我们推测它可能在黄瓜幼果早期发育中发挥作用，因此，对CsEXP10的差示片段进行了3’-和5’-RACE（rapid amplification of cDNA ends）延伸，以及与已知EST序列的拼接，得到长度为1191bp的cDNA序列。利用生物信息学方法，对csExP10基因序列及其氨基酸序列进行分析，并对该蛋白质的结构和功能进行了预测。Southern杂交结果表明，该基因在黄瓜基因组中以单拷贝形式存在。RT-PCR和Northern杂交显示，该基因主要在授粉后迅速生长的幼果组织中表达，而不在根、茎和叶组织中表达，也不在幼小子房、开花当天未经授粉子房和生长停止的果实中表达，因此推测它与授粉后黄瓜果实膨大生长有密切关系。该研究为今后深入探讨授粉启动果实膨大生长的分子机制奠定了基础，对改变瓜类作物的结果习性，促进单性结实利用等方面具有重要的意义。研究工作主要包括以下几个方面： 1 授粉后黄瓜幼果早期发育过程的观察

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 黄瓜概述
• 1.2 果实早期发育机制的探讨
• 1.2.1 激素在果实发育中期决定性作用
• 1.2.2 果实发育过程中的激素来源
• 1.2.3 果实发育的分子生物学研究
• 1.3 差异表达基因分离技术及其应用
• 1.3.1 mRNA差异显示
• 1.3.2 cDNA代表性差异分析
• 1.3.3 抑制性消减杂交
• 1.3.4 DNA芯片
• 1.3.5 cDNA-AFLP
• 1.4 扩张蛋白的研究进展
• 1.4.1 扩张蛋白的发现
• 1.4.2 扩张蛋白的分子特征
• 1.4.3 扩张蛋白的生化特性
• 1.4.4 扩张蛋白的基因家族和进化
• 1.4.5 扩张蛋白的作用机制
• 1.4.6 扩张蛋白的表达调控
• 1.4.7 扩张蛋白的功能分析
• 1.5 生物信息资源及生物信息学分析方法
• 1.5.1 生物信息学的产生
• 1.5.2 生物信息资源
• 1.5.3 生物信息学基本的分析方法
• 第二章 绪论
• 2.1 研究的目的和意义
• 2.2 研究的范围和内容
• 2.3 技术路线
• 第三章 授粉后黄瓜幼果的早期发育过程
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果与分析
• 第四章 授粉前后黄瓜幼果基因表达的差异显示
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 主要生化试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 总RNA和mRNA的制备
• 4.2.2 dscDNA的制备
• 4.2.3 cDNA-AFLP分析技术
• 4.2.4 cDNA差示片段的回收
• 4.2.5 cDNA差示片段的再扩增与检验
• 4.2.6 反向Northern杂交
• 4.2.7 差示片段的克隆
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 利用cDNA-AFLP技术分析授粉前后黄瓜幼果的基因表达差异
• 4.3.2 cDNA差示片段的回收检验
• 4.3.3 cDNA差示片段的表达特性
• 4.3.4 cDNA差示片段的克隆
• 4.3.5 cDNA差示片段的序列分析
• 第五章 黄瓜CsEXP10基因的克隆、生物信息学分析及表达
• 5.1 植物材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 总RNA的分离
• 5.2.2 sscDNA合成
• 5.2.3 CsEXP10基因cDNA序列的克隆
• 5.2.4 CsEXP10基因的生物信息学分析
• 5.2.5 RT-PCR表达分析
• 5.2.6 Northern杂交分析
• 5.2.7 Southern杂交分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 CsEXP10基因的cDNA序列
• 5.3.2 CsEXP10基因核苷酸序列分析
• 5.3.3 CsEXP10蛋白的氨基酸序列分析
• 5.3.4 CsEXP10基因及其编码蛋白的结构分析
• 5.3.5 CsEXP10基因在黄瓜不同组织部位的RT-PCR表达
• 5.3.6 CsEXP10基因在黄瓜不同果实发育阶段的Northern杂交
• 5.3.7 CsEXP10基因是单拷贝基因
• 第六章 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 缩写词
• 发表文章和参加课题
• 致谢