论文摘要
衰老是一个多方面衰退并呈现疾病倾向的生理过程,尽管有越来越多的证据表明miRNA （microRNA）参与对衰老的调节,但是对它在巨噬细胞中与年龄相关的表达变化及其调控机制还知之甚少。与年龄相关的免疫紊乱表现为细胞因子如TNFa和IL-6等的表达水平升高和对感染的敏感性增加。因此,miRNA作为在转录后水平上基因表达的重要调节因子,对其深入研究有助于我们更好地了解免疫衰老的机制,并可为延缓衰老提供新的策略。本论文分析了年轻及自然衰老小鼠巨噬细胞在炎症应答过程中miRNA的差异表达谱,使用LNA标记的芯片技术,鉴定出各自的差异表达miRNA,在衰老小鼠巨噬细胞中,16个miRNA的表达与LPS刺激无关,但在年轻组中却表现为上调或下调；对其中miR-146a、miR-223、miR-28和miR-lOla进行了q-PCR验证,结果与芯片结果基本一致,提示这些差异miRNA的表达可能与巨噬细胞的免疫衰老密切相关；利用生物信息学软件对这些差异miRNA的靶基因进行了预测,并通过GO （gene ontology）和KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）生物信息学分析,对这些靶基因进行了生物过程、分子功能、细胞组分以及信号通路方面的注释,并建立起免疫、凋亡以及转录因子和表观遗传学三个方面的miRNA-gene相互作用网络图,结果表明,这些靶基因参与了17条重要信号通路的调节。通过芯片和real time PCR的鉴定,我们发现衰老小鼠巨噬细胞中miR-146a具有较高的表达水平,且在体内及体外均对LPS刺激缺乏免疫应答。由于在衰老小鼠巨噬细胞中]miR-146a对LPS和促炎因子刺激均无反应,我们推测miR-146a的表达调控有其他调节机制,且其表达异常与炎症细胞因子表达异常有关；对miR-146a的调控机制研究发现,NF-κB与pre-miR-146a（primary miR-146a）启动子区结合异常导致了miR-146a在小鼠腹腔巨噬细胞中的表达异常；表观遗传学研究显示,衰老小鼠巨噬细胞中,DNA甲基化及组蛋白乙酰化均参与miR-146a的表达调控。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂TSA （trichostatinA）可显著提高衰老小鼠的巨噬细胞中NF-κB的活性和NF-κB p65与miR-146a启动子的结合能力,且HDAC表达水平比年轻小鼠巨噬细胞高。Real time PCR检测发现LPS处理小鼠腹腔巨噬细胞24小时的过程中,衰老小鼠细胞中HDAC 1-11个亚型的mRNA表达相对于年轻小鼠表现出更明显的变化趋势,但各个时间点的整体表达均比年轻小鼠高,说明高表达的HDAC显著抑制了衰老小鼠巨噬细胞miR-146a的表达。我们进一步探讨了miR-146a对巨噬细胞Th1/Th2类细胞因子表达的影响,以miR-146a mimics、阴性对照mimics （NC mimics）、抑制性miR-146a （miR-146a inhibitor）和抑制性miR-146a阴性对照（NC inhibitor）分别瞬时转染体外培养的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7以及腹腔新鲜分离的原代巨噬细胞,利用real time PCR定量检测IL-18、IL-5和IL-10的表达情况,结果证实,miR-146a能够负向调控Thl类细胞因子IL-18的表达,但是不能调控Th2类细胞因子IL-5及IL-10的表达。结论：本文鉴定了衰老小鼠巨噬细胞差异表达的miRNA,分析了其靶基因及其功能,证实miR-146a等的表达异常可导致衰老小鼠巨噬细胞功能异常,转录因子NF-κB和表观遗传学均参与了衰老小鼠巨噬细胞miR-146a的表达调控,为进一步理解巨噬细胞在小鼠衰老中的作用及其干预和延缓衰老提供了新的资料。