论文摘要
目的利用小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell, mESCs）为体外试验模型,探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）对mES细胞增殖、周期的细胞毒性作用;对mES细胞阶段特异性胚胎表面抗原（stage-specific embryonic antigen 1, SSEA-1）、Nanog、Oct-4、Sox1及Casp-3基因表达情况的影响;对Notch信号通路的作用。为进一步筛选病原体和其他毒素对干细胞增殖、胚胎发育相关基因表达的作用机制提供理论依据。方法采用饲养层培养法培养mES细胞,不同浓度的DON（0,50,100,500,1000,2000ng/ml）分别作用于对数生长期的mES细胞24小时,噻唑蓝（MTT）法检测DON对mES细胞增殖的影响;利用差速贴壁法纯化mES细胞,检测DON对细胞周期的影响;免疫细胞化学法观察DON对SSEA-1、Nanog、Oct-4、Sox1、Casp-3基因表达情况;Trizol裂解细胞提取mES细胞总RNA,RT-PCR检测DON对转录因子Oct-4,Nanog基因的影响;用RIPA细胞裂解液提取mES细胞总蛋白,检测DON对Notch信号通路基因表达的影响。结果1.DON对干细胞增殖的影响:将含有不同浓度DON的培养液加入对数生长期的mES细胞,继续培养24h后,观察DON对mES细胞增殖的作用,结果显示:随DON浓度的增加,吸光度值逐渐降低,DON浓度为50ng/ml、100ng/ml时,与空白对照组相比mES细胞增殖及存活率降低,但无统计学差异。当DON浓度为500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml时,吸光度值明显降低,与0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml组两两比较都有统计学意义（P<0.01）。DON在2000ng/ml时,显微镜下观察mES细胞可见细胞克隆团比500ng/ml、1000ng/ml组减小更加明显,细胞密度逐渐降低,但无统计学意义。实验发现随DON浓度的增加,抑制mES细胞增殖的作用逐渐增强。2.DON对细胞周期的影响:流式细胞仪检测结果显示:DON作用mES细胞24h后,随DON浓度的增加,细胞增殖指数降低。5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml组结果与空白对照组相比区别不明显,500ng/ml及2000ng/ml组与0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml组两两比较均有统计学意义（P<0.01）。2000ng/mlDON组作用mES细胞后比其它组S期降低显著,和500ng/ml组比较差异无统计学意义（P>0.05）。试验表明DON影响mES细胞周期的分布,具有明显的抗增殖作用。3.DON对基因表达的影响:免疫细胞化学法检测结果显示:DON浓度为100ng/ml时,Nanog、Sox1、Oct-4的表达量与空白对照组相比变化不明显,而当DON浓度为500ng/ml时,上述基因表达量明显减少;DON在10ng/ml、100ng/ml及500ng/ml时,casp-3基因表达与空白对照组相比无明显变化,DON浓度为2000ng/ml组,可见其亮度增加,表达量增多;SSEA-1的表达在500ng/ml DON组,与空白对照组相比,其平均光密度值增加明显（P<0.01）,差异有统计学意义,1000ng/ml组与500ng/ml组相比,表达量略有增加,但无显著性差异（P>0.05）。RT-PCR检测发现500ng/ml DON组可抑制Oct-4,Nanog mRNA的表达,与空白对照组比较有统计学意义（P<0.01）。随浓度的增加,Oct-4,Nanog的表达量降低,但1000ng/ml和500ng/ml组相比,无统计学差异（P>0.05）。4.DON对Notch信号通路的影响:Western blot检测显示:当DON浓度为10ng/ml时,NICD表达明显减少,提示Notch信号通路受到抑制,当DON浓度超过100ng/ml时,表达微弱,Notch信号通路抑制明显。Notch1受体Jag1、Notch1下游信号Hes1表达也随浓度增加减少明显。实验结果说明DON影响Notch信号通路,参与Notch信号通路的转导。结论1.DON对mES细胞有直接毒性作用,能抑制mES细胞的生长,影响细胞周期的分布,抑制细胞进入S期,使细胞停滞在G0/G1期,具有明显的抗增殖作用。2.SSEA-1、Oct-4、Nanog是mES细胞的特异基因,其转录水平直接影响mES细胞的分化和发育。DON作用mES细胞后,SSEA-1表达量升高, Oct-4、Nanog基因表达下降,从而影响mES细胞的增殖及分化,异常的分化可使胚胎早期的正常发育受到损害。3.Notch信号通路在胚胎发育、干细胞特性维持、细胞分化、增殖、凋亡等一系列活动中都起十分重要的作用。DON在低浓度（10ng/ml）时即可抑制Notch通路,影响mES细胞的特性维持、增殖及分化等,进而影响早期胚胎发育。