猪SOCS-2 cDNA基因的克隆、序列分析及表达研究

论文摘要

脂肪组织主要由大量群集的脂肪细胞构成,细胞水平脂肪组织的生长是前体脂肪细胞的增殖和分化,以及成熟脂肪细胞体积的增大。脂肪形成是转录水平改变大量脂肪相关蛋白活化的结果。细胞因子作用的显著特点是其作用的时间性及空间性均受到严格的调控,主要有3种蛋白质家族参与其信号转导的负调节,分别是SOCS、PIAS和SHP-1,其中以SOCS的研究较为深入。SOCS-2是该家族的主要成员,体内外大量研究表明,其在体内和体外都能调节多种细胞因子信号通路。其中,SOCS-2与GHR信号通路关系最为密切,是一种潜在的肌肉发育及体脂沉积研究的重要候选因子。本试验以猪为研究对象,克隆了猪SOCS-2基因,进行了序列分析并对其表达规律做了初步探讨,主要研究结果如下:1.克隆猪SOCS-2基因（GenBank登陆号为EF121242）,其长度为822 bp,该基因ORF区核苷酸序列与其他物种相比同源性达到93%以上,氨基酸同源性则达到89%以上,生物信息学分析表明该蛋白分子量为22.25KD,等电点pI=8.30,包含199个氨基酸残基。结构分析发现,该基因包含了完整的SH2和SOCS-box结构域。2.SOCS-2基因组织分布研究结果显示,SOCS-2基因在猪肌肉组织、肾脏、脾、肝脏、腹部脂肪、皮下脂肪、肺和心脏等组织中广泛表达,肾脏和心脏组织中表达较高,而在肌肉组织中表达量最低。这些结果进一步显示了SOCS-2在体内的多种功能,肌肉组织中SOCS-2表达量较低,这可能与其在GHR信号通路调控机体生长发育过程中的重要作用有关。3.本试验成功克隆了猪SOCS-2基因,在T4连接酶作用下,连接到pET-43a载体上,通过将pET-43a-SOCS-2重组子转化BL21表达菌,成功构建了猪SOCS-2基因原核表达系统,为进一步制备抗猪SOCS-2单克隆抗体以及相关研究奠定了一定的基础。4.SOCS-2在培养的猪原代脂肪细胞分化整个过程中都有表达,并从分化第2天开始,SOCS-2 mRNA水平呈时间依赖性方式递增,但是差异不显著。在体外培养的猪原代脂肪细胞自然分化过程中,脂肪细胞标志基因HSL,LPL,PPAR-γ2从细胞开始分化的第2天开始,同样呈时间依赖性递增。初步试验显示,体外培养的脂肪细胞自然分化过程中,SOCS-2与脂肪细胞分化标志基因mRNA表达量无明显相关性,但仍需进一步验证。这些结果表明,SOCS-2可能在脂肪细胞分化过程中没有作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 SOCS 家族简介
• 1.1 SOCS 家族的组成
• 1.2 SOCS 家族的结构特点
• 1.3 SOCS 基因转录和蛋白合成的调控
• 1.4 SOCS 家族成员的功能
• 1.5 SOCS 蛋白抑制细胞因子信号转导的机制
• 第二章 SOCS-2 调控GH 信号通路的研究进展
• 2.1 SOCS-2 的发现及结构
• 2.2 SOCS-2 基因表达的调节
• 2.3 SOCS-2 与GH 信号通路之间的关系
• 2.3.1 SOCS-2 与GH 信号通路调控肌肉和脂肪组织发育及脂代谢
• 2.3.2 GH 调节SOCS-2 的表达
• 2.3.3 SOCS-2 在GH 信号通路中的作用
• 2.4 SOCS-2 调控的其他细胞因子信号通路
• 第三章 前体脂肪细胞体外培养及细胞分化的研究概况
• 3.1 前体脂肪细胞体外培养
• 3.2 原代前体脂肪细胞离体培养特点
• 3.3 脂肪细胞分化过程
• 3.4 脂肪细胞分化的核转录因子调控
• 第二部分 实验研究
• 前言
• 第四章 猪SOCS-2 基因的克隆及序列分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果分析
• 4.2.1 组织提取RNA 的完整性
• 4.2.2 PCR 扩增结果
• 4.2.3 重组质粒的PCR 鉴定
• 4.2.4 克隆所得序列、Genbank 登陆号及同源性比对分析
• 4.2.5 蛋白结构预测
• 4.3 讨论
• 第五章 猪SOCS-2 基因组织分布研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 肾脏组织总RNA 的提取及检测
• 5.2.2 PCR 扩增结果
• 5.2.3 重组质粒鉴定
• 5.2.4 测序所得序列结构分析
• 5.2.5 克隆所得序列Genbank 登陆号及同源性比对分析
• 5.2.6 各组织总RNA 的提取
• 5.2.7 各组织SOCS-2 基因mRNA 表达丰度的差异性检验
• 5.3 讨论
• 第六章 猪SOCS-2 基因原核表达载体构建及表达
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验试剂
• 6.1.3 实验方法
• 6.1.3.1 表达引物的设计
• 6.1.3.2 重组表达质粒的构建
• 6.2 实验结果
• 6.2.1 猪SOCS-2 基因的克隆
• 6.2.2 重组表达质粒的鉴定
• 6.2.3 重组表达质粒的诱导表达
• 6.3 讨论
• 第七章 SOCS-2 MRNA 在猪原代脂肪细胞分化过程中的表达规律研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 实验材料
• 7.1.2 实验方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 SOCS-2 mRNA 在原代培养猪脂肪细胞分化过程中的表达变化
• 7.2.2 SOCS-2 与脂肪细胞分化标志基因表达量的变化
• 7.3 讨论
• 有待于进一步深入研究的问题
• 参考文献
• 附录
• 缩略词表（ABBREVIATION）
• 致谢
• 作者简介