维甲酸相关孤核受体α在α-黑素细胞刺激素及其类似物STY39调控树突状细胞成熟中的作用

论文摘要

维甲酸相关孤核受体a （retinoid acid receptor related orphan receptor, RORα, NR1F1）是一种属于类固醇激素受体超家族成员的转录调控因子,它能够直接进入细胞核调节靶基因的转录,从而参与多种重要生理过程的调节,在形态发育、细胞增殖分化、机体稳态维持、生物代谢调控、高级神经功能控制以及免疫调节等方面发挥重要作用。研究发现RORa基因缺陷的模型小鼠体内出现了广泛而严重的功能性障碍,尤其是容易罹患自身免疫性疾病和过敏性疾病,并表现出明显的免疫功能异常,如T细胞和B细胞功能缺陷、巨噬细胞释放致炎因子（如IL-1、IL-6、TNF-α）增多等。可以推断RORα与免疫系统的关系非常密切,其抗炎作用在多种疾病实验模型的研究中已得到证实。α-黑素细胞刺激素（alpha-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH）是一种内源性小分子神经内分泌免疫调节肽,它不仅能促进黑色素形成使皮肤变黑,而且具有明确的抗炎及免疫调节作用。α-MSH通过黑皮质素受体（melanocortin receptor, MCR）的介导发挥多种生理功能,这些受体广泛表达于各种组织,包括中枢神经系统、外周组织及免疫细胞。目前已知的MCR共有5种亚型（MC1R～MC5R）,除MC2R以外,其他受体均能结合α-MSH,其中MC1R和MC5R主要介导其抗炎和免疫调节作用。理论上,α-MSH作为天然的抗炎免疫调节剂可以用于自身免疫病、过敏性疾病的防治以及避免移植排斥反应,但由于其结合受体的选择性低,生物学作用不仅限于免疫调节,还能同时影响机体其他神经内分泌功能,导致皮肤变黑等,限制了α-MSH的实际应用。因此基于天然α-MSH结构特点和不同MCR亚型介导的效应,设计合成新的类似物将更具有应用于临床的前景。本实验室自主研制了α-MSH的新型类似物（专利授权号ZL200510026927.3,命名为STY39）,是一种对MC1R与MC5R均具有高选择性的激动剂。经前期实验已证明,STY39对LPS诱导的内毒素休克小鼠和博莱霉素诱导的急性肺部炎症和肺纤维化大鼠具有很好的保护作用,能显著抑制血管内皮细胞表达组织因子而上调组织因子途径抑制因子的表达,还能显著下调晚期炎症因子高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的表达以有助于控制炎症发展。树突状细胞（dendritic cells, DCs）是机体内功能最强的专职抗原提呈细胞,承接固有免疫和适应性免疫,是启动、调控和维持适应性免疫应答的关键。DCs的功能与其成熟状态密切相关：成熟DCs能有效激活免疫应答,在抗肿瘤、抗感染免疫方面意义重大；而非成熟DCs具有致免疫耐受性,在防治移植排斥和自身免疫病方面具有重要意义。本课题组在探究α-MSH对DCs分化成熟的调控作用中,己明确α-MSH可以抑制人外周血单核细胞来源DCs的发育成熟,且提示可能与RORα蛋白表达增高相关。联系己知关于RORα在抗炎过程中发挥的确切效应以及在细胞增殖分化中的作用,我们推测RORα亦可能参与DCs分化成熟的调控过程。因此本课题将深入研究RORα是否与DCs的分化发育有关,RORα在α-MSH调控DCs分化成熟中的作用与机制,迄今为止尚未见类似报道。本课题研究内容共分为以下四个部分。第一部分α-MSH及其类似物STY39对DCs表达RORα的影响目的：探明不同浓度α-MSH或其类似物STY39作用与RORα表达量之间的关系。方法：利用体外分离培养的小鼠骨髓来源DCs作为研究对象,用50 ng/ml TNF-α刺激DCs（TNF-α-DCs）,诱导DCs成熟,再分别以不同浓度α-MSH或STY39（10-6 mol/L、10-8mol/L、10-10mol/L和10-12mol/L）处理。然后于作用不同时间点,通过Western blotting法和实时荧光定量RT-PCR法检测RORα的蛋白和基因表达水平。结果：TNF-α-DCs中RORα蛋白和mRNA表达较对照组降低,在α-MSH （10-8、10-10 mol/L）或STY39（10-10 mol/L）作用后,RORα蛋白和mRNA的表达量均明显增加（P<0.05）。结论：α-MSH或STY39可以上调TNF-a刺激的小鼠骨髓来源DCs中RORα的表达。第二部分高表达RORα对TNF-α诱导DCs成熟的影响目的：观察RORα在细胞内高表达是否影响DCs的发育成熟。方法：首先构建rAAV-RORα-hrGFP重组质粒并转染TNF-α-DCs,获得高表达RORα的DCs（rAAV-RORα-hrGFP-TNF-α-DCs）,然后观察其表型变化和功能状态。用流式细胞术（FCM）检测DCs表型（Iab、CD86、CD54）；采用FITC-BSA吞噬实验并经FCM分析DCs吞噬抗原功能的变化；以3H-TdR掺入法测定DCs刺激抗原特异性T细胞增殖的能力；ELISA检测DCs产生IL-6、IL-12、IL-10的水平。结果：与rAAV-IRES-hrGFP-TNF-α-DCs（空载体对照）相比,rAAV-RORα-hrGFP-TNF-α-DCs呈现以下变化：①Iab、CD86、CD54分子的表达明显下调；②吞噬FITC-BSA的功能增强（P<0.05）；③刺激抗原特异性T细胞增殖的能力明显减弱（P<0.01）；④IL-6和IL-12的分泌减少（P<0.05）,而IL-10的分泌水平明显上升（P<0.01）。结论：使TNF-α刺激的DCs内高表达RORα可以抑制DCs的发育成熟。第三部分RORα在α-MSH及其类似物STY39抑制DCs成熟中的作用目的：研究RORα在α-MSH或STY39抑制DCs成熟过程中的作用。方法：设计合成RORα的siRNAs,采用RNA干扰技术沉默TNF-α-DCs中RORαmRNA的表达,观察10-10mol/Lα-MSH或STY39作用后[即α-MSH （or STY39）-RORα-siRNA-TNF-α-DCs],是否改变其成熟状态。测定指标包括：DCs的表型（Iαb、CD86、CD54）、吞噬功能、刺激抗原特异性T细胞增殖的能力以及产生IL-6、IL-12、IL-10的水平,方法同第二部分。结果：与α-MSH（or STY39）-non-siRNA-TNF-α-DCs（非特异性干扰对照组）相比,α-MSH（or STY39）-ROR-siRNA-TNF-α-DCs发生如下改变：①IαbCD86、CD54分子的表达水平明显增高；②吞噬BSA抗原的功能降低（P<0.05）；③刺激抗原特异性T细胞增殖的能力增强（α-MSH, P<0.05; STY39,P<0.01）；④IL-6和IL-12的分泌水平升高（P<0.05）,而IL-10的分泌减少（α-MSH,P<0.05；STY39,P<0.01）。结论：α-MSH或STY39抑制TNF-α-DCs成熟可能部分地通过诱导RORα高表达介导。第四部分RORα参与α-MSH及其类似物STY39抑制DCs成熟的机制目的：探讨RORα参与α-MSH及其类似物STY39抑制DCs成熟的相关信号转导通路。方法：①将DCs分为：未成熟对照组（imDCs）、50 ng/ml TNF-α刺激组（TNF-α-DCs）、10-10 mol/Lα-MSH或STY39处理组[α-MSH（or STY39）+TNF-α-DCs]、rAAV-RORα-hrGFP-TNF-α-DCs组和rAAV-IRES-hrGFP-TNF-α-DCs（空载体对照）组,用实时荧光定量RT-PCR的方法检测不同处理组α-MSH的天然受体（MC-1-5R）的表达情况；②利用各种信号转导通路特异性阻断剂包括SB203580 （p38/MAPK）、GF10933X （PKC）、H89 （PKA）、PD98059 （ERK1/ERK2）和PDTC（NF-κB）等分别作用于经10-10 mol/Lα-MSH或STY39+TNF-α处理的DCs,然后采用实时荧光定量RT-PCR方法检测各组RORα的mRNA表达情况；③通过Western blot检测TNF-α-DCs高表达RORα后细胞内NF-κB p65和IκBα蛋白的表达情况；④采用双荧光素酶报告基因法检测TNF-α-DCs高表达RORα后以及STY39+TNF-α-DCs的RORα被干扰表达后NF-κB的转录活性。结果：①MC-1-5R可组成性表达于DCs, TNF-α作用后可上调MC1R和MC5R的表达量（P<0.01）下调MC3R和MC4R的表达量（P<0.05）;②α-MSH和STY39均能上调TNF-α-DCs的MC1R表达（P<0.05）,STY39还能上调imDCs的MC5R表达（P<0.05）；③细胞内高表达RORα可使imDCs和TNF-α-DCs表达MC1R增加（P<0.05）；④经α-MSH或STY39+TNF-α刺激的DCs,使用阻断剂SB203580、GF10933X或H89作用后,RORαmRNA的表达量均明显降低（P<0.01）；⑤高表达RORα可显著减少TNFα-DCs胞核内NF-κB p65蛋白含量、增加胞浆内IκBα蛋白含量,同时抑制NF-κB的转录活性（P<0.01）；干扰RORα表达的TNFα-DCs在STY39作用后,NF-κB转录活性明显高于未干扰对照组（P<0.05）。结论：在α-MSH或STY39抑制TNF-α诱导DCs成熟的过程中,可由MCR介导通过多种信号转导途径（p38/MAPK、PKC、PKA）上调RORα在TNF-α-DCs中的表达。高表达RORα一方面通过上调IKBα蛋白表达量、抑制NF-кB的转核与转录活性,导致DCs的成熟信号转导受阻；另一方面可诱导MCR表达以进一步增强起始信号,从而发挥抑制DCs分化成熟的作用。综上所述,本课题发现RORα参与了DCs发育成熟的调控；在α-MSH或其类似物STY39抑制TNF-α诱导DCs成熟的过程中,RORα发挥了非常关键的作用；α-MSH或STY39可通过MCR介导下游多种信号转导通路（如p38/MAPK、PKC、PKA等）使RORα的表达增加,并使TNF-α刺激的DCs表达MC-1R和MC-5R上调；高表达的RORα一方面增加MBα的表达量、抑制NF-κB的核移位和转录活性,另一方面又可促进MCR的表达以进一步增强起始信号,从而发挥抑制DCs分化成熟的作用。本研究有助于深入阐明α-MSH及其类似物STY39的抗炎和免疫调节作用机制,为探寻以DCs为基础的防治自身免疫病、肿瘤、感染以及移植排斥反应的新措施提供了新靶点,并为探明神经内分泌免疫调节网络在疾病发生与防治中的作用提出了新证据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分:α-MSH及类似物STY39对DCs表达RORα的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分:高表达RORα对TNF-α诱导DCs成熟的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分:RORα在α-MSH及其类似物抑制树突状细胞分化成熟中的作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分:RORα参与α-MSH及其类似物STY39逆转树突状细胞分化成熟信号转导途径的机制研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 综述参考文献
• 致谢