大鼠矽肺纤维化差异表达基因的筛选与验证

论文摘要

矽肺（Silicosis）是由于在生产过程中长期吸入含有游离二氧化硅（silicon dioxide,SiO2）粉尘而引起的以矽结节形成和肺间质纤维化（pulmonary interstitial fibrosis,PIF）为主的职业性肺病,以肺泡持续性损伤、成纤维细胞（fibroblast,FB）增殖及大量细胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积而导致肺组织反复破坏、修复,最终造成肺组织中大量胶原沉积为病理特点。以往研究表明,矽肺纤维化的发生、发展是复杂的多阶段过程,其中有众多细胞因子、蛋白酶系统和转录因子等的参与及相互作用,因而有可能涉及众多基因的表达活动。该过程中的基因表达十分错综复杂,单个特异基因表达的分析方法不能阐述其复杂的机制。所以,利用基因芯片将在此过程中可能存在着的相互协调的基因群体作为一个整体系统进行研究,大规模地筛选出在矽肺纤维化发生发展过程中起关键调控作用的差异表达基因,是从基因水平深入探讨矽肺纤维化发病机制的新思路。目的本实验以SD大鼠气管灌注SiO2粉尘制作矽肺模型,采用基因芯片技术对染尘的实验组肺组织和灌注生理盐水的对照组肺组织基因表达谱进行比较研究,在基因组范围内大规模筛选矽肺病差异表达基因,并利用多种方法对差异表达基因进行验证,以期发现重要的矽肺病相关基因,为有效地预防、治疗这一顽疾提供靶点。方法1.购进30只SD大鼠后,先适应性饲养一周,采用随机数字表将大鼠分为2个组,即对照组和实验组,对照组6只,实验组24只。其中实验组又分为3个时间点,分别为30d、60d和90d,每个时间点8只大鼠。2.对实验组大鼠采用非气管暴露法染尘制作矽肺大鼠模型,对照组灌注生理盐水。经HE切片确定建模成功,Van Gieson（VG）染色看胶原纤维生成情况。3.提取总RNA,用紫外分光光度计法检测RNA的纯度,并取总RNA样品进行甲醛变性凝胶电泳,检测总RNA完整性。4. RNA质检合格后,选择实验组大鼠60d和对照组大鼠肺组织的总RNA,选用博奥生物有限公司提供的27K Rat Genome Array共有约26962条70 mer长度的Oligo DNA,进行基因芯片杂交。5.比较染尘的实验组和灌注生理盐水的对照组肺组织芯片结果,找出差异基因,并用RT-PCR、免疫组织化学及Western Blot在组织标本上进行鉴定。6.应用凝胶图像分析系统对RT-PCR结果进行图像采集和分析,应用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对免疫组织化学结果进行图像采集和分析测定,用Image J分析软件对Western Blot结果进行半定量分析处理。资料整理后,应用SPSS Statistics V17.0统计软件,多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计学分析。结果1.肺组织切片HE染色可见,对照组各时间点大鼠肺组织结构清晰,仅见轻微炎症反应;实验组大鼠肺组织正常结构破坏,肺组织局部病灶融合成较大的肉芽肿,其中可见较多的巨噬细胞、淋巴细胞等,形成大小不一的矽结节。肺组织切片VG染色可见,对照组大鼠各时间点及实验组大鼠30d、60d的肺组织仅见血管壁的基底膜上胶原纤维呈红色,实验组90d的矽结节内可见呈红色的胶原纤维。2.肺组织总RNA质量检测,经紫外分光光度计测定,实验组的各时间点和对照组的大鼠肺组织总RNA OD260/OD280>1.9。甲醛变性凝胶电泳显示,各样品电泳图谱有清晰的28S、18S条带和一条浅的5S条带,且肉眼观察28S条带亮度约为18S的1.5倍。3.肺组织样品与基因芯片杂交,从26962个基因中共筛选出实验组与对照组的差异表达基因338个（包括尚未在GenBank注册的大鼠全长新基因73个）。其中上调基因267个（包括尚未在GenBank注册的大鼠全长新基因67个）,下调基因71个（包括尚未在GenBank注册的大鼠全长新基因6个）。4.选择明显上调的基质金属蛋白酶-12（matrix metalloproteinase-12,MMP-12）和组织蛋白酶（Cathepsin）E基因进行验证分析。经RT-PCR验证,实验组大鼠肺组织30d、60d、90d时,MMP-12 mRNA表达的吸光度值分别为对照组的4.306、5.338、6.713倍,Cathepsin E分别为1.434、2.974、3.889倍;经免疫组织化学验证,实验组大鼠肺组织30d、60d、90d时,MMP-12蛋白表达的平均光密度（OD）值分别为对照组的1.435、1.746、2.069倍,Cathepsin E分别为1.372、1.663、2.103倍;经Western Blot验证,实验组大鼠肺组织30d、60d、90d时,MMP-12蛋白表达的OD值分别为对照组的1.214、1.531、1.959倍,Cathepsin E分别为1.262、1.828、1.907倍。与对照组相比,实验组大鼠肺组织MMP-12和Cathepsin E mRNA和蛋白表达量明显上调,且上调的趋势与基因芯片的结果一致,差异有显著性（p<0.05）。结论本次实验利用基因芯片筛选出矽肺纤维化大鼠肺组织的差异表达基因,进一步深入研究了矽肺发病的分子机制,提示矽肺的发生可能存在复杂的基因调控网络,多种基因共同作用调控着矽肺纤维化的发生发展。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 不足与展望
• 附图
• 参考文献
• 综述 肺纤维化相关因子研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历