应用AAV介导人α-synuclein基因体内转染建立突触核蛋白病大鼠模型

论文摘要

第一部分MBP启动子介导α-synuclein表达AAV载体的构建目的构建携带髓鞘碱性蛋白（MBP）启动子介导的人α-synuclein基因的腺相关病毒载体,并测定其病毒滴度,为神经变性疾病的实验研究奠定基础。方法通过PCR扩增获得目的基因α-Synuclein及启动子MBP的cDNA,将外源基因定向亚克隆到穿梭质粒pSNAV2.0,构建重组质粒pSNAV2-CMV-α-Synuclein和pSNAV2-MBP-α-Synuclein,共转染293T细胞,包装产生rAAV2-α-Synuclein.最后进行病毒滴度测定。结果通过PCR证实外源性α-Synuclein and MBP基因已正确插入重组腺相关病毒载体。rAAV2-CMV-α-Synuclein和rAAV2-MBP-α-Synuclein的病毒滴度分别为5.6×1011vg/ml、3.1×1011vg/ml.结论成功构建了rAAV2-α-Synuclein载体并获得了较高滴度的包装病毒颗粒,为神经变性疾病奠定了实验基础。第二部分突触核蛋白病大鼠模型制作与行为及病理学评价目的构建过表达α-synuclein基因的突触核蛋白病大鼠模型,观察基因表达后大鼠运动功能的行为学及病理学变化,为突触核蛋白病大鼠模型的制备提供一种新的方法。方法通过立体定向方法将rAAV-α-synuclein载体注射入大鼠黑质中,构建过表达α-synuclein基因大鼠模型,四个月后观察大鼠行为学的改变,并通过平衡杆实验和爬杆实验,来评价α-synuclein对大鼠运动协调能力的影响。采用HE染色及Nissl染色观察黑质细胞形态学改变情况,结果α-synuclein基因过表达后大鼠出现自发性活动减少、爬行活动减慢、竖毛等类似PD初期的症状和体征。对照组大鼠并没有表现出帕金森样症状。在平衡杆实验中,实验组大鼠过杆潜伏期和过杆时间均延长（P<0.05）。而在爬杆实验中,实验组大鼠的调头时间、爬杆时间与对照组相比均有不同程度的延长（P<0.05）。病理学证实实验组大鼠黑质区域神经元及尼氏体数量较对照组明显减少,体积缩小,结构欠清晰。结论rAAV介导的a-synuclein基因在大鼠黑质过表达,对大鼠的运动行为及病理方面产生一定的影响,出现类似于PD早期的症状与体征,此动物模型可模拟神经变性疾病缓慢发展的进程,为研究神经变性疾病的发病机制提供一个理想的动物模型。第三部分突触核蛋白病大鼠模型的初步鉴定目的研究a-synuclein过表达对多巴胺能神经元酪氨酸羟化酶（TH）表达的影响,进一步观察a-synuclein在脑内的表达情况以及相应的解剖病理基础。方法采用免疫组织化学染色观察大鼠皮质、纹状体、黑质、小脑、脑干部位的a-synuclein免疫活性变化,以及黑质区TH免疫反应阳性神经元的表达情况,采用双重免疫荧光方法分析a-synuclein和TH的表达以及两者之间的关系。采用Western blotting检测大鼠各脑区a-synuclein基因蛋白的表达。结果a-synuclein在实验组大鼠皮层、纹状体、黑质、小脑、脑干表达明显增加,以纹状体、黑质、脑干表达更多。实验组较对照组黑质部a-synuclein阳性染色增多,阳性细胞数增多,可见路易小体,具有显著差异（p<0.05）。大鼠黑质TH免疫阳性的多巴胺神经元数量减少,TH蛋白表达降低。a-synuclein的表达主要在黑质致密部的多巴胺能神经元。a-synuclein过表达明显抑制多巴胺能神经元的TH表达。结论我们己成功建立过表达人a-synuclein的突触核蛋白病大鼠模型,可为今后神经变性病的发病机制及治疗方面的研究提供一种新的动物模型。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 MBP启动子介导α-synuclein表达AAV载体的构建
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 突触核蛋白病大鼠模型制作与行为及病理学评价
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图表
• 第三部分 突触核蛋白病大鼠模型的初步鉴定
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图表
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢