锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制动力学研究

论文摘要

以锯缘青蟹（Scytta Serrata）内脏为材料,通过含0.2 mol/LNaCl的0.01 mol/LTris-HCl（pH 7.5）缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱过滤层析、DE-32离子交换柱层析,分离提纯NAGase（NAGase）,获得比活力为7,990U/mg的电泳单一纯NAGase制剂（NAGase,EC 3.2.1.52）。本文以此酶制剂为对象展开以下几方面的研究。研究过氧化氢对锯缘青蟹NAGase活力的影响及抑制动力学。其结果表明,过氧化氢对该酶有显著的抑制作用,随着过氧化氢浓度的增高,酶活力呈指数下降,测出可使酶活力下降50%的过氧化氢浓度(抑制半衰期,IC50)为0.115 mol/L。低浓度过氧化氢对该酶的抑制过程显示为可逆效应。采用底物反应动力学方法研究过氧化氢对该酶的抑制作用动力学、建立动力学模型,测定游离酶（E）和酶-底物络合物（ES）的微观抑制速度常数k+0和K′+0并加以比较。实验结果(k+0＞k′+0)表明底物对酶被过氧化氢的抑制作用有一定的保护作用。过氧化氢可能是通过氧化酶活性中心功能基团而导致酶活性的丧失。该研究对了解NAGase的功能基团性质及酶的催化作用机理提供重要的实验基础。研究脲对酶的效应,结果表明,脲对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）有失活作用,随着脲浓度的增大,酶活力呈指数下降,测定导致酶活力下降50%的脲浓度(失活半衰期,IC50)为0.63 mol/L。酶在脲溶液中的失活过程显示为可逆失活。用底物反应动力学方法考察酶在脲溶液中的失活动力学,测定游离酶（E）和酶-底物络合物（ES）在脲溶液中失活的微观速度常数,并比较游离酶（E）和酶-底物络合物（ES）的正向反应的微观失活速度常数,表明底物存在对酶被脲的失活作用有一定的保护作用。正向的失活速度常数k+0和k′+0随着脲浓度的增大而增大,而逆向的速度常数k-0随着脲浓度的增大而减小。表明随着脲浓度的增大,酶变性越来越快,而活力恢复越来越难。研究十六种氨基酸对酶的效应,结果表明:非极性氨基酸中Gly、Ala、leu、Phe对酶活力几乎没有作用,Val、Ile对酶略有激活,Val浓度为20 mmol/L使酶活力提高7.5%,Ile浓度为40 mmol/L,使酶活力提高10.5%。Pro,Met对酶活力略有抑制作用,当Pro浓度为40 mmol/L时分别使酶活力下降15.2%,当Met浓度为40 mmol/L时分别使酶活力下降9.8%.极性氨基酸Asn、Cys、Ser、Thr对酶的活力没有影响。带负电荷的酸性氨基酸Asp和Glu对酶有抑制作用,当Asp浓度为40 mmol/L时,使酶活力下降38%;当Glu浓度为40 mmol/L时,可使酶活力下降25%。带正电荷的碱性氨基酸His略有抑制,Lys和Arg抑制作用较强,研究Lys和Arg对酶催化pNP-NAG水解反应的抑制机理,并测定其抑制常数,结果表明Lys和Arg的对酶的抑制均表现为可逆效应,抑制类型均为反竞争性抑制,其Kis分别为5.29 mmol/L和3.76 mmol/L。研究对-氯汞苯甲酸（pCMB）对NAGase的化学修饰作用,巯基是酶活性的必须基团。氯化汞对锯缘青蟹NAGase抑制动力学研究,结果证明:当汞离子浓度小于1.0 lamol/L时,汞离子对剩余酶活力的作用表现为可逆反应,汞离子对酶的抑制机理属于竟争性抑制类型。通过汞离子对酶抑制作用的动力学模型的建立,测定游离酶（E）和酶.底物络合物（ES）在氯化汞溶液中失活的微观速度常数,研究汞离子浓度与表观速度常数之间的关系,结果证明:仅一分子氯化汞结合到酶分子活性中心就可导致酶活性的丧失。实验结果提示半胱氨酸残基位于酶活性中心,是酶分子的必须基团。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 第一章 引言
• 1.1 锯缘青蟹及几丁质简介
• 1.1.1 锯缘青蟹简况
• 1.1.2 几丁质简况
• 1.2 NAGase的生理功能与应用
• 1.2.1 酶在生物机体内的生理功能
• 1.2.2 酶在参与生物化学调控方面的作用
• 1.2.3 酶作为生化指标在疾病诊断中的应用
• 1.3 NAGase研究概况
• 1.3.1 微生物NAGase
• 1.3.2 植物NAGase
• 1.3.3 动物NAGase
• 1.3.4 NAGase的分子生物学
• 1.4 本论文研究内容、目的和研究意义
• 第二章 实验材料、仪器与方法
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 蛋白质浓度的测定
• 2.3.2 酶活力和比活力的测定
• 2.3.3 酶的分离纯化
• 2.3.4 酶的纯度鉴定
• 2.3.5 酶催化pNP-NAG水解反应的动力学性质研究
• 2.3.5.1 pH对酶的活力的影响
• 2.3.5.2 酶对pH稳定性测定
• 2.3.5.3 温度对酶的活力的影响
• 2.3.5.4 酶对热稳定性测定
• 2.3.5.5 酶催化pNP-NAG水解的动力学参数
• 2.4 效应物对酶活力的影响
• 2.4.1 过氧化氢对酶活力的影响
• 2.4.2 脲对酶活力的影响
• 2.4.3 氨基酸对酶活力的影响
• 2.4.4 汞离子对酶活力的影响
• 2.4.5 效应物对酶的作用机理判断
• 2.4.6 效应物对酶的抑制作用类型
• 2.4.7 酶的抑制或失活作用动力学
• 第三章 实验结果
• 3.1 酶分离纯化与纯度鉴定
• 3.1.1 锯缘青蟹NAGase分离纯化
• 3.1.2 锯缘青蟹NAGase纯度鉴定
• 3.2 酶催化pNP-NAG水解反应的动力学性质
• 3.2.1 酶催化pNP-NAG水解反应的最适pH
• 3.2.2 酶催化pNP-NAG水解反应的pH稳定性测定
• 3.2.3 酶催化pNP-NAG水解反应的最适温度
• 3.2.4 酶的热稳定性测定
• 3.2.5 酶催化pNP-NAG水解的动力学参数测定
• 3.3 过氧化氢对酶活力的影响
• 3.3.1 过氧化氢对酶的活力的影响
• 3.3.2 过氧化氢对酶的抑制类型
• 3.3.3 过氧化氢对酶的抑制动力学模型的建立
• 3.3.4 过氧化氢对酶的抑制微观速度常数测定结果
• 3.4 脲对酶活力影响及动力学研究
• 3.4.1 脲浓度对酶活力的影响
• 3.4.2 酶在脲溶液中的失活作用表现为可逆过程
• 3.4.3 酶在不同浓度脲溶液中的失活动力学过程
• 3.4.4 酶在脲溶液中的失活微观速度常数的测定
• 3.5 氨基酸对酶活力的影响
• 3.5.1 非极性氨基酸对酶活力的影响
• 3.5.1.1 甘氨酸对酶活力的影响
• 3.5.1.2 丙氨酸对酶活力的影响
• 3.5.1.3 苯丙氨酸对酶活力的影响
• 3.5.1.4 亮氨酸对酶活力的影响
• 3.5.1.5 缬氨酸对酶活力的影响
• 3.5.1.6 异亮氨酸对酶活力的影响
• 3.5.1.7 脯氨酸对酶活力的影响
• 3.5.1.8 甲硫氨酸对酶活力的影响
• 3.5.2 极性氨基酸对酶活力的影响的浓度效应
• 3.5.2.1 天冬酰胺对酶活力影响
• 3.5.2.2 半胱氨酸对酶活力影响
• 3.5.2.3 丝氨酸对酶活力影响
• 3.5.2.4 苏氨酸对对酶活力影响
• 3.5.3 酸性氨基酸对酶活力的影响的浓度效应
• 3.5.3.1 天冬氨酸对酶活力的影响的浓度效应
• 3.5.3.2 谷氨酸对酶活力的影响的浓度效应
• 3.5.4 碱性氨基酸对酶活力的影响的浓度效应
• 3.5.4.1 赖氨酸对酶活力的影响的浓度效应
• 3.5.4.2 精氨酸对酶活力的影响的浓度效应
• 3.5.4.3 组氨酸对酶活力的影响的浓度效应
• 3.5.5 碱性氨基酸对NAGase的抑制机理
• 3.5.5.1 赖氨酸对NAGase的抑制机理
• 3.5.5.2 精氨酸对NAGase的抑制机理
• 3.5.6 碱性氨基酸对酶的抑制作用类型与抑制常数的测定
• 3.5.6.1 赖氨酸对酶的抑制作用类型与抑制常数的测定
• 3.5.6.2 精氨酸对酶的抑制作用类型与抑制常数的测定
• 3.6 汞离子对酶活力的影响
• 3.6.1 汞离子对酶的活力的影响
• 3.6.2 汞离子对酶的抑制类型
• 3.6.3 汞离子对酶的抑制动力学模型的建立
• 3.6.4 汞离子对酶的抑制微观速度常数测定结果
• 第四章 讨论
• 4.1 酶的分离纯化及催化pNP-NAG水解反应的动力学性质
• 4.2 酶催化机理的研究
• 4.3 过氧化氢对酶活力的影响
• 4.4 脲对酶活力影响及动力学研究
• 4.5 氨基酸对酶活力的影响
• 4.6 汞离子对酶活力的影响
• 结论
• 参考文献
• 硕士生期间已发表论文
• 致谢