论文摘要
背景:器官移植后器官功能维持的主要障碍是术后排斥反应和免疫抑制剂毒性。共刺激信号是调节T细胞免疫反应状态的重要机制,直接影响移植后机体T细胞介导的排斥反应的发生及反应强弱。Na?ve T细胞的激活除了需要MHC-抗原肽提供的第一信号以外,还需要共刺激分子提供的第二信号。CD28分子家族提供的第二信号能够提供给T细胞激活所需的第二信号,共抑制分子在自身耐受和防止自身免疫疾病的维持和发生中也扮演了重要的角色,近期克隆出的HVEM-BTLA分子途径是继CTLA4和PD1之后的又一个对T细胞激活有重要调控作用的分子。近年的发现显示CD28家族的BTLA分子与TNFR超家族的HVEM分子是一对发挥对T细胞活化调控的分子基础之一。HVEM除了能够与BTLA结合之外,它还是淋巴毒素（LT）和LIGHT分子的配体,其中HVEM-LIGHT途径在T细胞激活过程中扮演的是一个激活效应。在我们的研究中我们对HVEM分子进行改造,其中对LIGHT结合位点进行了突变处理,删除其与LIGHT分子途径的效应,保留对BTLA分子途径的效应。并将其构建到复制缺陷型腺病毒转染载体中,对移植物进行原位的基因转染,观察其对小鼠异位心脏移植物存活的影响。目的:通过巢式PCR扩增HVEM全长cDNA片断,并对其进行分子改造;将突变后的HVEM分子构建到带EGFP基因的复制缺陷型腺病毒载体中,构建双表达腺病毒载体;观察HVEM突变体对体外混合淋巴细胞反应（MLR）的影响和对小鼠实体器官转染效率的测定;建立小鼠小鼠异位心脏移植模型同时观察HVEM突变体转染对心脏移植物存活的影响。方法:用巢式PCR扩增HVEM全长cDNA,并用PCR的方法对cDNA片段中LIGHT结合位点进行突变,将HVEM突变体基因片断插入复制缺陷型腺病毒载体,构建带HVEM基因和EGFP基因双表达的腺病毒基因组重组质粒;转染293包装细胞,筛选HVEM和EGFP高效表达的重组腺病毒,对腺病毒毒性和可复制性进行检测;通过体外实验混合淋巴细胞反应（MLR）检测HVEM蛋白的生物学功能;通过对比常温和低温对腺病毒转染实体脏器效率的影响,并观测目的基因在心脏等实体脏器中的表达;改良并稳定建立同种异体小鼠颈部异位心脏移植模型,应用小鼠异位心脏移植模型平台观察携带HVEM突变体基因腺病毒对小鼠心脏移植物存活的影响。结果:（i）成功构建了含有HVEM突变体的重组腺病毒载体;（ii）该重组腺病毒能成功地使靶细胞表达HVEM突变体蛋白,并且具有相应的生物学功能。（iii）重组后腺病毒能有效转染染供体小鼠心脏。（iv）使用携带HVEM突变体基因腺病毒感染供体小鼠心脏,能有效减轻移植后急性排斥反应,以及能显著延长移植心的存活时间。结论:在本研究中,成功构建了表达HVEM重组腺病毒载体;使用携带HVEM基因腺病毒感染供体小鼠心脏,能有效减轻移植后急性排斥反应,以及能显著延长移植心脏的存活。