论文摘要
每年全球的糖尿病患者数量在不断上升。世界卫生组织调查数据显示1985年全球只有3000万糖尿病患者,而2000年骤增至1亿5千万,这个数字将在2025年增加到3亿5千万。由于老龄化和肥胖人群的增加导致了这个数字的增加,而且其中大部分为2型糖尿病患者。大量研究证明,有效控制高血糖可以减缓、控制糖尿病的发展。但是临床实践中对血糖控制却远不如人意,即使应用最佳治疗方案,目前的糖尿病治疗手段无法使很多病人长期有效控制血糖。其中的原因有无法辅助和维持必要的生活方式改变、没有有效的联合治疗、抗糖尿病药物具有副作用和疾病本身的病理特点。因此亟需更有效的和具有更好耐受性的治疗药物。而胰高血糖素样肽-1（GLP-1）,一种由肠道L细胞分泌的31或30个氨基酸的多肽,可以较好的满足这些需求:GLP-1可促进胰岛素分泌,有效控制血糖;可促进胰岛素合成甚至胰岛细胞增殖再生,从根本上解决胰岛素来源;可减缓胃排空、刺激中枢神经产生饱足感,从而减少食物摄入和体重增加,对肥胖引起的糖尿病尤为重要;葡萄糖依赖性降血糖作用,可避免低血糖症,同时几乎没有副作用。正因如此,GLP-1成为糖尿病治疗的新宠,受到越来越多的关注,从上世纪80年代被发现到第一个GLP-1类药物Byetta上市,前后不过20多年时间。但是天然GLP-1在体内半衰期非常短,只有1-3分钟,很难直接用于治疗。主要原因是GLP-1在体内很快被二肽酶-4（DPPⅣ）降解所致。突变二肽酶-4识别位点（Ala8）,可以有效延长其半衰期。同时,作为肽类药物,一般需要靠注射给药,给病人带来痛苦;而最佳的给药途径是口服给药。本研究试图通过对突变天然GLP-1内的DPPⅣ识别位点来抵抗其降解,延长体内半衰期;通过突变天然GLP-1中胰酶的识别位点（精氨酸、赖氨酸）来部分抵抗肠胃道内消化酶的降解,从而达到口服的目的。然后试图将通过大肠杆菌表达筛选到的突变体克隆到乳酸菌、植物中表达,主要内容如下:1.本文设计了将Ala8突变为Ser8,Lys26突变为Gln26和Lys34突变为Asp34,并在C末端增加Cys的突变方案,合成命名为DTrGLP-1的突变体基因克隆到pET-32a（+）载体中得到pET-32a-DTrGLP-1,将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。BL21（DE3）/pET-32a-DTrGLP-1在1mmol/L的IPTG诱导表达4个小时后收获菌体,超声破碎,用金属螯和层析的方法纯化,收集200mM,500mM咪唑洗脱的产物超滤浓缩,得到了较纯的融合蛋白。按36nmol/L/kg融合蛋白直接灌胃给药,在小鼠体内测得降血糖作用,一直持续到给药后90分钟。初步得到了口服有效的GLP-1突变体,但其活性有待进一步提高。2.为了进一步改善GLP-1的半衰期,对Arg36进行突变,利用PCR的方法分别定点突变成Ala,Gly,Leu,Asp,Glu,Try,Gin或His,分别命名为A36-DTrGLP-1,G36-DTrGLP-1,L36-DTrGLP-1,D36-DTrGLP-1,E36-DTrGLP-1,T36-DTrGLP-1,Q36-DTrGLP-1和H36-DTrGLP-1。类似地,通过克隆得到了基因工程菌BL21（DE3）/pET-32a-X36-DTrGLP-1（X为A,G,L,D,E,T,Q或H）。用自诱导的方法,将1%活化的基因工程菌种接种于ZYP培养基中,37℃、230r/min转速下培养16小时,表达得到了各突变体的菌体。通过破碎、Ni柱亲和层析纯化得到了电泳纯度达95%左右的各突变体多肽,得率在30%左右。1nmol/L各纯化突变体的融合蛋白胰酶酶切混合物在MIN6细胞上测得促胰岛素分泌活性,活性相对DTrGLP-1略有下降。口服融合蛋白的实验显示,T36-DTrGLP-1、D36-DTrGLP-1、G36-DTrGLP-1和A36-DTrGLP-1具有较好的口服降血糖效果,最长可以持续8小时。筛选到了长效适合口服的GLP-1突变体,接下来将突变体克隆到乳酸菌和植物中表达。3.乳酸菌饮品因具有多种保健作用而越来越受到人们的喜爱。本文选取遗传背景较清楚,应用较多的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作为表达系统。将优化了密码子的DTrGLP-1基因克隆到pNZ8149并转化到NZ3900,得到乳酸乳球菌基因工程菌NZ3900/pNZ8149-LAB-DTrGLP-1,在nisin诱导下表达了GLP-1突变体;活菌喂食小鼠实验显示,与对照组相比,NZ3900/pNZ8149-LAB-DTrGLP-1可减轻小鼠体重增加。但未检测到降血糖作用,具体原因有待进一步研究。4.番茄作为一种可以直接使用的果实,同时具有遗传背景比较清楚,常作为植物基因工程药物的模式植物;同时它具有很好的保健作用,颇受市场欢迎。本文利用病毒表达载体PVX的强大表达外源蛋白的功能,将口服有效的长效GLP-1突变体克隆到PVX中,得到了病毒表达载体PVX-X36-DTrGLP-1-GFP（x为A,G,D,T）。通过体外传录侵染烟草,在10天后检测到目的基因在烟草中有很强的表达。通过注射接种的方法将带有GLP-1突变的病毒接种于番茄果实中,14天后RT-PCR检测到GLP-1突变体的表达。给小鼠灌胃表达有GLP-1突变体的番茄,结果显示,60分钟后,T36-DTrGLP-1-GFP,D36-DTrGLP-1-GFP,G36-DTrGLP-1-GFP均有降血糖活性;但仅G36-DTrGLP-1-GFP在210分钟后,仍有降血糖活性。至此初步得到了具有降血糖作用的基因工程番茄。本文通过对GLP-1进行基因工程改造,得到了可口服的较长效的GLP-1突变体,并在乳酸乳球菌和番茄中表达,测得口服活性,为其应用做了有益的探索。