论文摘要
【目的】探讨云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化及成纤维细胞活化过程中的相互作用和相关机制。【方法】（1）选用100μg/ml的云锡矿粉毒染永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B及人胚肺成纤维细胞WI-38,每次染毒72h,隔代染毒直至第9代。自第11代将上述细胞共培养,实验分组如下:B组,W组,B100组,W100组,B（W）组,B（W100）组,B100（W）组,B100（W100）组,W（B）组,W（B100）组,W100（B）组,W100（B100）组。（2）倒置显微镜行活细胞形态观察。（3）流式细胞仪分析细胞周期变化。（4）刀豆凝集素A凝集实验及锚着独立性生长实验检测上皮细胞转化。（5）免疫细胞化学染色检测成纤维细胞活化标志α-SMA表达、上皮细胞FHIT基因蛋白和Ki-67抗原的表达变化。（6）酶联免疫吸附实验检测上皮细胞培养上清液中TGF-β1的含量。（7）免疫印迹检测成纤维细胞FAP、TβRⅡ、HGF表达及Smad2/3磷酸化水平;同法检测上皮细胞TβRⅡ表达及c-Met磷酸化水平。【结果】（1）云锡矿粉诱导支气管上皮细胞后,细胞形态改变,凝集实验及锚着独立性生长实验阳性,S期比例明显增高,发生恶性转化;与成纤维细胞共培养后恶性转化时间提前。（2）第16代各组成纤维细胞α-SMA为阴性表达;第26代经矿粉打击的成纤维细胞出现α-SMA表达,第36代其表达进一步增强;并以与上皮细胞共培养组明显。（3）未经矿粉打击的各组、各代上皮细胞FHIT蛋白表达相似。矿粉打击后上皮细胞FHIT蛋白表达水平逐渐降低直至表达缺失;转化晚期重现FHIT蛋白的表达,成纤维细胞能促进这一过程的发生。（4）未经矿粉打击的各组上皮细胞ki—67抗原表达相似,随培养代数的增加矿粉打击后的上皮细胞增殖指数逐渐递增,且各组问存在统计学差异（P＜0.05）。（5）第16代各组成纤维细胞未检测到FAP蛋白表达。第26代矿粉打击的成纤维细胞检测到FAP蛋白表达,各组表达水平相似。第36代时FAP蛋白表达进一步增强,并以与上皮细胞共培养组明显;同时与受矿粉打击上皮细胞共培养的成纤维细胞也出现了FAP蛋白表达。（6）各组BEAS-2B细胞培养上清存在TGF-β1。各代未受矿粉打击上皮细胞TGF-β1分泌无明显差异。受矿粉打击的上皮细胞培养上清TGF-β1含量升高,并以转化早期明显,而后维持一相对平稳水平。（7）BEAS-2B细胞中存在TβRⅡ,第16代时各组细胞TβRⅡ无明显差异,第26代时受矿粉打击的各组上皮细胞TβRⅡ表达下降,至第36代TβRⅡ表达缺失。未受矿粉打击的各组上皮细胞第26、36代TβRⅡ表达无明显差异。（8）第36代各组各组成纤维细胞均存在TβRⅡ,各组间表达量相似,无表达缺失。（9）第26代与经矿粉打击的上皮细胞共培养的各组成纤维细胞出现Smad2/3蛋白磷酸化。（10）WI-38成纤维细胞中存在HGF表达,矿粉诱导后表达水平随培养代数增加而升高。其与经矿粉诱导的上皮细胞共培养后,表达水平明显提高。并且与受矿粉打击上皮细胞共培养的成纤维细胞培养至第26代时,HGF表达水平轻度升高,至36代时其表达水平进一步增强,与此一致,共培养后的相应上皮细胞组出现了HGF受体c-Met的磷酸化。【结论】（1）云锡矿粉能诱导支气管上皮细胞发生恶性转化、成纤维细胞发生活化。（2）经矿粉打击的成纤维细胞能够促进经矿粉打击的上皮细胞增殖和转化,同样,经矿粉打击的上皮细胞能促进成纤维细胞活化。（3）单纯矿粉打击后的上皮细胞能使未经矿粉打击的成纤维细胞发生活化转变,而单纯矿粉打击后的成纤维细胞不足以使未经矿粉打击的上皮细胞发生转化。上皮细胞是矿粉诱癌的主要靶细胞。（4）矿粉诱导上皮细胞转化的早期存在FHIT蛋白的丢失,这一事件能被成纤维细胞所促进,提示FHIT可能是矿粉诱癌的一个作用靶点,其表达的减弱或缺失可作为预测肺癌发生危险的生物学标志。（5）活化的成纤维细胞表达α-SMA及FAP,且时间早于上皮转化特征的出现,其α-SMA及FAP的表达可能是肺癌进展的一个早期分子事件。（6）矿粉诱癌过程中,上皮细胞培养上清的TGF-β1含量升高,并以转化早期明显,而后维持—相对平稳水平;转化上皮细胞TβRⅡ表达降低直至缺失;活化成纤维细胞TβRⅡ无明显变化,Smad2/3磷酸化水平升高,提示TGF-β1在矿粉诱癌早期可能起抑制作用,后期通过旁分泌途径起促进作用。（7）矿粉诱癌过程中,活化成纤维细胞HGF表达升高,与之共培养相应上皮细胞c-Met磷酸化水平的升高提示活化的成纤维细胞可能通过HGF/c-Met信号通路促进上皮细胞的转化。