转录因子KLF8在肝细胞肝癌生长与侵袭转移中的作用研究

论文摘要

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上的第三大癌症杀手,在中国处在第二位,占全部恶性肿瘤死亡人数的18.8%。虽然手术切除仍是可能获得治愈的主要方法,但根治性切除术后复发率仍然相当高,还有更多的肝癌患者因肿瘤转移而失去根治的机会。复发特别是转移性复发是延长肝癌病人生存的一个主要障碍。不幸的是当前可获得的病理学及免疫学指标还不足以敏感到对转移性肿瘤进行精确预测,辅助治疗也不能有效预防转移复发,因而肿瘤转移仍是研究中的一个极重要的课题。探讨肝癌发生发展和转移复发的相关因素及分子机理,寻找肝癌早期诊断、预测转移的生物标记和干预治疗的靶分子,对其诊断和治疗具有重要的理论指导和临床应用意义。Kr（u|¨）ppel-like factor 8（KLF8）最初是作为Kr（u|¨）ppel样Cys2/His2锌指转录因子蛋白质家族的一个转录抑制蛋白而被识别的,通过与辅抑制子碳端结合蛋白（CtBP）相联系抑制基因表达。有研究表明KLF8的表达在卵巢癌、肾癌以及乳腺癌的细胞系以及卵巢癌的原发肿瘤组织中是升高的,KLF8是v-Src诱导的致癌转换所必需的,在人类肿瘤的进展中发挥作用。最近研究显示KLF8是一个很强的上皮间质转换（EMT）和侵袭的诱导蛋白。而其在肝（癌）细胞中的表达及其与HCC发生、侵袭转移及临床预后等的关系尚无相关研究。本课题旨在通过对比和分析不同转移潜能人HCC细胞系的KLF8表达及由314例有完整的临床和随访资料的HCC组织构建的组织芯片、有和无转移HCC组织标本中KLF8的表达,研究KLF8在HCC中的表达情况及其过表达与HCC临床预后的关系;通过靶向KLF8的小干扰RNA和构建表达shRNA-KLF8的慢病毒载体pGCSIL-KLF8并将其包装成慢病毒颗粒来（转染）感染HCCLM3细胞,在体外和体内探索下调KLF8基因表达对HCC生长及侵袭转移的作用,并通过比较下调和未下调KLF8的HCCLM3之间基因转录谱的差异初步探讨KLF8促进HCC生长与侵袭转移的作用机制,为HCC转移的基因治疗提供新的靶点。第一部分转录因子KLF8在不同肝癌细胞系及组织中的表达目的:观察正常肝细胞系L-02、不同转移潜能的肝癌细胞系及不同肝（癌）组织中KLF8的表达,初步探讨KLF8表达在肝细胞肝癌中的意义。方法:Real-timePCR、western blot、免疫细胞化学检测不同肝（癌）细胞系中KLF8的mRNA和蛋白质水平;RT-PCR检测不同肝（癌）组织中的KLF8 mRNA水平;免疫组织化学检测不同肝（癌）组织中的KLF8蛋白表达。结果:在不同的肝癌细胞系中KLF8的mRNA及蛋白质水平随着肝癌细胞系侵袭转移潜能的增强而显著升高（P＜0.05）,KLF8主要表达于癌细胞的核内;KLF8的mRNA水平在正常肝组织中低,而在肝细胞肝癌组织中较高,在有明确转移的肝细胞肝癌组织中更高;KLF8蛋白表达的阳性率在正常肝组织和肝硬化组织中低而在肝细胞肝癌组织中很高,在肝癌转移灶中最高（强阳性率达83.3%,p＜0.001）。结论:KLF8在不同转移潜能的肝癌细胞系及不同肝（癌）组织中表达有差异,其可能参与肝细胞肝癌的发生和侵袭转移。第二部分转录因子KLF8在肝癌组织中的表达与肝癌临床病理特征及预后的关系目的:研究转录因子KLF8在肝细胞肝癌组织中的表达,探讨KLF8与肝细胞肝癌临床病理特征和预后的关系。方法:应用Real-time PCR检测50例肝细胞肝癌组织中KLF8 mRNA的表达;Western Blot检测10例肝细胞肝癌组织中KLF8蛋白的表达;检测由314例肝细胞肝癌组织构建的组织芯片中KLF8蛋白的表达,SSPS11.5统计分析其与肝细胞肝癌临床病理特征及预后的关系。结果:在肝癌组织样本中,相对于无复发的肝细胞肝癌病人标本,有复发的病人标本具有较高的KLF8 mRNA表达水平（p=0.001）;Western blot分析显示KLF8蛋白在5例有复发的病人标本中高表达,而在5例无复发的病人标本中仅1例高表达,其他的表达很弱或无表达。KLF8-组的5-年总生存率OS和肿瘤复发率是60.3%和41.9%,而KLF8+组是48.7%和59.8%,p=0.038和p=0.005。分层分析显示:在TNM stageⅠ的病人中KLF8+病人的5-年肿瘤复发率相对于KLF8-病人来说是显著增加的（54.6%vs.35.3%,p=0.008）;同样的结果存在于BCLC 0+A期的病人中（57.0%vs.37.9%,p=0.009）;在AFP≤20 ng/ml组中,KLF8-和KLF8+病人的5-年肿瘤复发率分别是41.5%和60.3%（p=0.027）;而在Edmondson stageⅠ-Ⅱ组中,KLF8-和KLF8+病人的5-年肿瘤复发率分别是36.5%和54.3%（p=0.005）。KLF8过表达在病人早期复发中具有预测作用（p=0.001）,而对于病人晚期复发无预测作用（p=0.623）。KLF8+与肝癌的早期复发相关（p=0.008）;单变量分析示KLF8对总生存率OS（p=0.040）和无复发生存时间TTR（p=0.006）有预后作用。多变量分析显示KLF8是OS（p=0.037）和TTR（p=0.018）的一个独立预后因素。结论:KLF8过表达与肝癌的早期复发相关,对总生存率OS和无复发生存时间TTR的不良预后有预测作用,是肝细胞肝癌病人的OS和TTR的独立预后因素。在TNM stage I、BCLC 0+A期、AFP≤20 ng/ml、Edmondson stageⅠ-Ⅱ病人中KLF8过表达提示高复发概率,KLF8过表达病人早期复发的概率高。第三部分下调KLF8表达抑制HCCLM3增殖和侵袭能力的体外实验及其可能的机理研究目的:考察KLF8表达的下调对HCCLM3细胞增殖和侵袭能力的影响并探讨其可能的机理。方法:siRNA下调KLF8后,MTT实验观察HCCLM3的增殖能力的改变;Transwell侵袭实验观察其侵袭能力的改变;基因芯片技术考察下调KLF8及未下调KLF8的HCCLM3之间的差异表达基因,荧光定量PCR验证部分差异表达的基因;RT-PCR、Western blot、免疫组织化学考察部分差异表达基因。结果:siRNA下调KLF8后HCCLM3的增殖（p＜0.0001）和侵袭能力（p＜0.0001）显著降低;基因芯片结果提示许多参与肿瘤发生发展的基因表达发生改变,KLF8参与多条肿瘤信号通路。结论:KLF8通过参与多条信号通路来调控HCCLM3的增殖及侵袭能力;其在肝细胞肝癌的发生发展中具有重要作用。第四部分下调KLF8的HCCLM3在裸鼠体内的成瘤及转移能力研究目的:研究KLF8的下调对HCCLM3在裸鼠体内的成瘤及转移能力的影响。方法:构建KLF8shRNA慢病毒载体,包装成慢病毒颗粒后感染HCCLM3细胞,接种雄性裸鼠,观察其对HCCLM3在裸鼠体内的成瘤与肺转移能力的作用。结果:对照组和实验组均可在裸鼠皮下成瘤;对照组老鼠的肿瘤重量显著大于KLF8下调组老鼠的肿瘤重量（3.67±0.75g vs.1.02±0.78g,p＜0.001）;KLF8下调组的老鼠相对于对照组老鼠其肿瘤组织中具有更多的坏死灶,对照组老鼠和KLF8下调组老鼠间肿瘤肺转移的发生率分别是100%（6/6）和16.7%（1/6）（p=0.015）。KLF8下调组的肿瘤转移灶大小局限于I级而大多数的对照组里的转移灶是Ⅲ-Ⅳ级。结论:KLF8的下调抑制HCCLM3在裸鼠体内的成瘤及肺转移能力,KLF8可以作为HCC的一个治疗靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 转录因子KLF8在不同肝癌细胞系及组织中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 转录因子KLF8在肝癌组织中的表达及其与肝癌临床病理特征和预后的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 下调KLF8表达抑制HCCLM3增殖和侵袭能力的体外实验及其可能的机理
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 下调KLF8的HCCLM3在裸鼠体内的成瘤及转移能力研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 附
• 致谢