柑橘中冷胁迫相关miRNAs的克隆与鉴定

论文摘要

我国拥有丰富的柑橘品种和悠久的栽培历史,是柑橘的原产地和生产大国。柑橘业是我国区域经济发展,新农村建设的支柱产业。冷胁迫是柑橘生长发育和地理分布的重要制约因素,严重影响柑橘的产量和品质。MiRNA是一类长约21-22nt的单链非编码RNA,通过切割靶基因或抑制其翻译,能协调许多基因的表达,调节植物的激素分泌和信号转导,增强植物对恶劣环境的适应能力。关于miRNA参与植物适应非生物胁迫的研究已有报道,但是miRNA与冷胁迫的关系研究较少。研究柑橘中冷胁迫相关的miRNA,为发现柑橘中新的miRNA及其基因调控模式,改良柑橘品种,提高柑橘对冷胁迫的耐受性,促进柑橘产业的发展,具有十分重要的意义。主要研究成果如下：1以前期研究发现的柑橘中27个miRNAs为研究对象,通过整合基因芯片数据、对miRNAs前体结构及靶基因功能的预测和启动子区顺式作用元件的分析,筛选出柑橘中5个冷胁迫相关的miRNAs。2提取金橘幼嫩叶片中总RNA,用通用引物Oligd（T）进行逆转录合成cDNA,再PCR扩增,克隆到miRNAs 167a、miRNAs 167d和miRNAs171的前体。3通过设计特殊的茎环引物进行逆转录,采用Stem-loop RT-PCR的方法和从总RNA中分离出小分子miRNAs,给小分子miRNAs加poly（A）尾,再采用RT-PCR这两种方法均检测到miRNA 156和（?）niRNA166这两种miRNAs成熟体。4将金橘在4℃条件下分别冷处理0、0.5h、4h、8h和14天后,提取其叶片中的RNA,用半定量RT-PCR法检测这5个miRNAs的表达变化,发现在冷胁迫下miRNA 167a和miRNA167d的表达模式相似,miRNA156、miRNA 166和miRNA171的表达模式各不相同。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 植物冷胁迫的研究进展
• 2.1 植物冷胁迫的生理反应机制
• 2.2 CBF与植物冷驯化
• 2.3 冷胁迫下的植物分子信号转导
• 2.4 冷胁迫有关的生化物质
• 2.5 冷胁迫相关的基因和miRNAs
• 3 miRNA的研究进展
• 3.1 miRNA的生物合成
• 3.2 miRNA生物合成的调节
• 3.3 miRNA的作用机制
• 3.4 miRNA与植物的抗逆性
• 3.5 植物miRNA的特点
• 3.6 miRNA与siRNA
• 3.7 miRNA与植物激素及信号转导
• 4 研究目标和意义
• 5 技术路线
• 第二章 柑橘中冷胁迫相关miRNAs的筛选
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 芯片数据
• 2.2 柑橘中冷胁迫相关的miRNAs靶基因的预测
• 2.3 miRNAs前体预测
• 2.4 启动子分析
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第三章 柑橘中冷胁迫相关miRNAs前体的克隆
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 仪器和主要试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 柑橘叶片中总RNA的提取与纯化
• 2.3.2 RNA质量检测与浓度测定
• 2.3.3 RT-PCR对柑橘中miRNA前体的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA提取电泳检测结果
• 3.2 RT-PCR对miRNAs前体的鉴定结果
• 4 讨论
• 第四章 不同方法鉴定miRNA成熟体
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 仪器和主要试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 柑橘叶片中总RNA的提取与纯化
• 2.3.2 小分子miRNA的分离
• 2.3.3 小分子miRNA加poly（A）尾反应
• 2.3.4 RT-PCR
• 2.3.5 stem loop RT-PCR
• 2.3.6 PCR产物测序
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第五章 柑橘中冷胁迫相关的miRNAs的表达分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料处理
• 2.2 仪器和主要试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 柑橘叶片中RNA的提取与纯化
• 2.3.2 内参基因的选择
• 2.3.3 PCR循环数的确定
• 2.3.4 PCR体系的优化
• 2.3.5 不同时间冷胁迫下柑橘中miRNAs的差异表达
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 作者简历
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文