p，p’-DDE、β-BHC联合作用对大鼠睾丸支持细胞Ca2+、ERK和BCL-2表达的影响

论文摘要

有机氯农药滴滴涕（2,2-bis（4-chlorophenyl）-1,1,1-trichloroethane, DDT）和六六六（benzene-hexachloride, BHC）是污染范围广、危害大、在环境中残留时间长并可通过食物链的生物放大作用进入机体的持久性有机污染物（persistent organicpollutants, POPs）,可在机体脂肪组织和血脂中存留数十年。p,p’-DDE和β-BHC分别是有机氯农药DDT和BHC的主要代谢产物,在人体和其他动物体内的水平较高。研究表明,这些有机氯农药及其代谢产物多具有生殖内分泌干扰作用,特别是对男性生殖功能的影响已引起人们的高度重视。有报道指出,在哺乳动物睾丸中,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase, MAPK）可调节细胞增殖、分化及凋亡,被认为是精子发育的重要决定因素之一。Bcl-2家族和Ca2+在细胞凋亡中的作用受到人们的重视,在生殖方面的研究越来越广泛。本实验室前期研究表明p,p’-DDE可诱导睾丸支持细胞ERK MAPK信号通路的激活,对睾丸支持细胞产生明显的影响,但p,p’-DDE、β-BHC单独及联合染毒作用对大鼠睾丸支持细胞Ca2+、ERK MAPK信号通路和Bcl-2影响如何,尚未见报道。以Sertoli细胞（睾丸曲细精管中唯一的体细胞）作为靶细胞,以p,p’-DDE、β-BHC作为受试物,两者单独及联合染毒,探讨p,p’-DDE、β-BHC单独及联合染毒作用对Ca2+、ERK/MAPK信号通路和Bcl-2的影响,为揭示有机氯农药对雄性生殖系统的可能机制提供实验室依据。第一部分大鼠睾丸支持细胞的离体培养和p,p’-DDE、β-BHC及其联合作用对支持细胞的活力影响目的:探讨p,p’-DDE、β-BHC单独及其联合染毒作用对支持细胞活力的影响来确定细胞的作用剂量。方法:对离体培养的支持细胞分别用10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、70μmol/L的p,p’-DDE、β-BHC单独及联合染毒24h后用MTT比色法测定其在490nm的吸光度值。结果:p,p’-DDE、β-BHC单独及其联合染毒作用于支持细胞24h后支持细胞的吸光度值随着浓度增加呈降低趋势。p,p’-DDE、β-BHC单独作用,50μmol/L、70μmol/L剂量组与溶剂对照组比差异有统计学意义（P<0.05）,50μmol/L两者联合染毒组与溶剂对照比较有显著性差异（P<0.05）;其他剂量组与溶剂对照组比没有显著差异。结论:p,p’-DDE、β-BHC浓度高于50μmol/L影响支持细胞的活力;p,p’-DDE、β-BHC联合染毒对支持细胞活性的影响大于两者单独染毒,提示两种农药联合染毒有一定的协同效应。第二部分p,p’-DDE,β-BHC单独及联合染毒对支持细胞Ca2+的影响目的:探讨p,p’-DDE,β-BHC及联合作用对支持细胞内Ca2+的影响。方法:用流式细胞术检测细胞内Ca2+荧光强度的变化。结果:p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒后,大鼠睾丸支持细胞内Ca2+荧光强度随着染毒剂量的增大呈升高趋势。不同剂量染毒组与溶剂对照组比较,显著差异（P<0.05）。结论:p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒作用,可使细胞内Ca2+浓增加,提示两种农药单独及联合染毒可使细胞损伤,诱导细胞凋亡。第三部分p,p’-DDE、β-BHC及联合作用对大鼠睾丸支持细胞erk和bcl-2 mRNA表达的影响目的:探讨p,p’-DDE、β-BHC及联合染毒对支持细胞内erk、bcl-2基因表达的影响。方法:用Real-time PCR方法检测支持细胞erk、bcl-2在mRNA水平上的表达情况。结果:1.不同剂量p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒作用于大鼠睾丸支持细胞24h erkmRNA基因表达情况:大鼠睾丸支持细胞erk mRNA表达率在p,p’-DDE、β-BHC及两者联合染毒组中随着剂量的增高呈降低趋势,跟溶剂对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。2.不同剂量p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒作用于大鼠睾丸支持细胞24hbcl-2 mRNA基因表达情况:大鼠睾丸支持细胞bcl-2 mRNA表达水平随着p,p’-DDE、β-BHC及联合染毒浓度的增加而降低,p,p’-DDE各染毒组、β-BHC的中高剂量组以及两者联合染毒各剂量组跟对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:p,p’-DDE、β-BHC及二者联合染毒作用于大鼠睾丸支持细胞后,erk、bcl-2基因转录水平明显降低,且β-BHC单独作用强于p,p’-DDE单独作用。第四部分p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒对大鼠睾丸支持细胞p-Erk、Erk蛋白表达的影响目的:探讨p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒作用对支持细胞的ERK MAPK信号转导通路的影响。方法:Western blotting方法来半定量p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒,不同染毒剂量下p-Erk的表达情况以及在相同浓度（50μmol/L）染毒后不同时间内p-Erk的表达情况。结果:1.不同剂量p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒作用与大鼠睾丸支持细胞24h内p-Erk、Erk蛋白表达情况:p-Erk蛋白表达水平随着p,p’-DDE单独浓度的增加先增高接着降低然后又增强;p-Erk蛋白表达水平在β-BHC单独和联合染毒组中随着染毒剂量的增加呈降低趋势,呈剂量依赖性（P<0.05）;两者联合染毒组p-Erk蛋白表达水平均显著低于单独染毒组,各溶剂对照组之间蛋白表达水平均无显著性差异（p>0.05）;2.相同剂量（50μmol/L） p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒作用后不同时间点大鼠支持细胞p-Erk、Erk蛋白表达情况:p,p’-DDE单独作用24h小时内p-Erk蛋白表达水平先出现一个短暂的抑制,而后表达水平升高,且在6h蛋白表达量最大,而后又下降;β-BHC单独及两种农药联合染毒,24小时内p-Erk蛋白表达水平先升高,在6h时达最大值,之后呈减低趋势。相同剂量p,p’-DDE、β-BHC及其联合染毒作用大鼠睾丸支持细胞后,Erk蛋白表达水平随着时间没有明显的变化,表达量之间没有显著差异（p>0.05）。结论:本研究表明,p,p’-DDE、β-BHC单独及其联合染毒均可以引起大鼠睾丸支持细胞ERK磷酸化水平的表达,激活ERK MAPK信号转导通路,但随着浓度的增大和时间的延长p-Erk蛋白的表达水平降低,说明两者长时间高浓度作用激活细胞保护机制的同时也可能激活了细胞的凋亡机制,而细胞的凋亡机制随着时间和剂量的延长起主导作用,诱导支持细胞凋亡而影响精子的正常发生,同时两者还有一定的协同效应。

论文目录

• 英文缩写
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 p,p’-DDE,β-BHC 及其联合作用对大鼠睾丸支持细胞活力的影响
• 材料和方法
• 结果和讨论
• 讨论
• 2+的影响'>第二部分 p,p’-DDE,β-BHC 及其联合染毒对支持细胞 Ca²⁺的影响
• 材料和方法
• 结果和讨论
• 讨论
• 第三部分 p,p'-DDE,β-BHC 及其联合作用对大鼠睾丸支持细胞 erk、 bcl-2 mRNA 表达的影响
• 材料和方法
• 结果和讨论
• 讨论
• 第四部分 p,p’-DDE,β-BHC 及其联合作用对大鼠睾丸支持细胞 p-Erk ,Erk 蛋白表达的影响
• 材料和方法
• 结果和讨论
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 2+离子在细胞凋亡的研究进展'>综述 ERK-MAPK 信号通路、BCL-2 家族和 Ca²⁺离子在细胞凋亡的研究进展
• 附录
• 致谢