游离脂肪酸增高致胰岛β细胞功能紊乱的机理研究

论文摘要

第一部分:脂毒性对胰岛β细胞自身胰岛素信号通路及分泌功能的影响及机制目的:探讨高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的变化及机制。方法:将8周龄雄性SD大鼠随机分为高脂饲料组（HF组,20只）和正常饲料组（NC组,20只）。各组分别饲养至20周,（1）采空腹血检测血糖、胰岛素,测血中及胰腺组织甘油三酯含量;胰腺组织切片行HE染色;（2）胰岛细胞表面灌注实验,评价离体胰岛β细胞动态分泌功能;（3）正常血糖高胰岛素钳夹试验,评价外周组织胰岛素抵抗程度;（4）采用实时荧光定量PCR方法比较两组大鼠胰岛素受体底物-1（IRS-1）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）、磷酯酰肌醇3激酶（PI3K）和葡萄糖转运子-2（Glut-2）mRNA表达的变化。结果:（1）HF组胰岛素、血中和胰腺组织TG水平显著高于NC组（P＜0.01）;高脂组大鼠胰岛内可见脂质沉积;（2）HF组大鼠葡萄糖输注率（GIR）较NC组明显降低（P＜0.01）;HF组葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）功能明显降低;（3）HF组胰岛细胞IRS-1 mRNA表达降低42.3%,IRS-2及PI3K分别降低28.1%、16.8%,Glut-2mRNA表达降低22.9%,（P均＜0.05）。（4）相关分析显示:胰腺组织TG水平与胰岛细胞IRS-1 mRNA表达呈负相关（r=—0.623,P＜0.05）;且与IRS-2 mRNA表达也明显负相关（r=—0.537,P＜0.05）。结论:高脂饲养导致大鼠胰岛β细胞胰岛素信号转导分子基因表达下降,可能与胰腺组织TG的异位沉积有关。第二部分:大剂量抗氧化剂对高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的影响及机制目的:探讨大剂量抗氧化剂—N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-l-cysteine,NAC）对高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的影响及可能机制。方法:8周龄SD大鼠随机分为正常饲料组（NC组）,高脂饲料组（HF组）,和高脂+NAC组（NAC组）。饲养20周,（1）测血浆及胰腺组织丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）水平;（2）正常血糖高胰岛素钳夹实验,评价外周组织胰岛素抵抗程度;（3）胰岛细胞表面灌注实验,评价离体胰岛β细胞动态分泌功能;（4）实时荧光定量PCR方法比较各组大鼠胰岛素受体底物-1（IRS-1）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）和葡萄糖转运子-2（Glut-2）mRNA表达的变化。结果:（1）HF组血浆及胰腺MDA水平明显高于NC组,GSH水平低于NC组,NAC可以改善以上变化;（2）HF组葡萄糖输注率（GIR）比NC组降低（P＜0.01）,用NAC后GIR明显改善（P＜0.01）;HF组葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）功能下降,用NAC后可逆转上述变化;（3）HF组胰岛细胞IRS-1、IRS-2、Glut-2mRNA表达降低42.3%、28.1%、22.9%（P均＜0.05）;NAC组胰岛细胞IRS-1、IRS-2、Glut-2mRNA表达与HF组相比增加40.2%、30.2%,19.1%（P均＜0.05）。结论:大剂量抗氧化干预治疗能改善胰岛细胞胰岛素信号传导,逆转高脂饲养导致的大鼠胰岛细胞分泌功能紊乱,其机制可能与NAC纠正机体氧化及抗氧化失衡有关。第三部分:氧化应激-PI3K/Akt通路与高FFA所致的INS-1细胞分泌功能的紊乱目的:本试验观察了棕榈酸对INS-1细胞胰岛素分泌功能及氧化应激-PI3K/Akt通路的影响及抗氧化剂干预的作用,旨在探讨氧化应激及β细胞自身的胰岛素信号通路在T2DM发病中所起的作用及机制。方法:大鼠胰岛β细胞系接种于6孔板（2×105/孔）中,除对照组外,分别加入0.2mmol/L棕榈酸和/或0.2mg/mlNAC以及50nm/L Wortmannin进行干预。各组每24h更换RPMI 1640培养基,细胞达70%汇片生长时,各组细胞分别加入干预,孵育48h。胰岛素释放实验检测β细胞对高糖刺激的反应能力;细胞内硝基酪氨酸测定,反映氧化应激的情况;实时荧光定量PCR检测胰岛素及PDX-1基因表达水平,Western blot检测磷酸化的Akt水平。结果:（1）P组和P+NAC组的ISI较NC组均明显降低,但是P+NAC组的ISI较单独加棕榈酸组明显升高（NC:2.12±0.17;P:0.84±0.12:P+NAC:1.16±0.11,P＜0.05）（2）P组和P+NAC组细胞内胰岛素mRNA表达较NC组细胞分别下降了37.4%（P＜0.05）和22.6%,细胞内PDX-1 mRNA表达分别下降了32.1%（P＜0.05）和27.5%。（3）P组和P+NAC组细胞内NT含量较NC组升高（mmol/l,NC:0.14±0.03;P:0.37±0.02;P+NAC:0.25±0.0.02,P＜0.05）。（4）培养基中加入10nmol/L胰岛素孵育1 h后,P组P-Akt的蛋白表达水平较正常对照组降低,NAC可部分逆转上述变化,加入50nm/LWortmannin后,P-Akt表达受抑制。结论:氧化应激产物增加可能影响胰岛细胞PI3K-Akt活性,使胰岛素信号通路受阻,进而导致胰岛细胞分泌功能障碍。第四部分:胰岛素信号通路在高游离脂肪酸所致的β细胞功能紊乱中的作用及机制目的:观察血浆游离脂肪酸（FFA）水平升高对β细胞胰岛素分泌功能的影响,探讨β细胞胰岛素信号通路在其中所起的作用及机制。方法:将8周龄雄性SD大鼠随机分为脂肪乳输注组（FFA组,13只）和生理盐水输注组（NS组,12只）。分别输注48小时,检测以下指标:（1）采血检测胰岛素,FFA水平。（2）正常血糖高胰岛素钳夹实验,评价外周组织胰岛素抵抗程度。（3）静脉葡萄糖耐量实验,评价活体胰岛β细胞分泌功能。（4）胰岛细胞表面灌注实验,评价离体胰岛β细胞动态分泌功能。（5）采用实时荧光定量PCR方法检测肌肉中胰岛素受体底物-1（IRS-1）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）mRNA表达的变化。（6）实时荧光定量PCR方法检测胰岛细胞IRS-1、IRS-2和葡萄糖转运子-2（Glut-2）mRNA表达的变化。结果:（1）FFA组血中胰岛素水平比NS组增高（24.44±1.25 uIU/ml VS 18.09±1.37uIU/ml,P＜0.05）,FFA水平也显著高于NS组（1.39±0.18mmol/1 VS 0.64±0.10mmol/1,P＜0.001）;（2）FFA刺激后,离体和活体的胰岛β细胞分泌功能均增强。（3）FFA组葡萄糖输注率（GIR）较NS组明显降低（P＜0.05）,提示存在明显的外周胰岛素抵抗;（4）FFA组肌肉IRS-1 mRNA表达比NS组降低87.7%,IRS-2表达降低50.7%（P均＜0.05）（5）FFA组胰岛细胞IRS-1 mRNA表达增加29.3%（P＜0.05）,IRS-2及Glut-2分别增加345.1%、536.4%（P均＜0.01）。结论:血浆FFA水平短期升高,造成外周胰岛素抵抗的同时,对β细胞胰岛素分泌有刺激作用,此时胰岛细胞胰岛素信号通路分子基因表达增加。

论文目录

• 中英文缩略
• 中文摘要
• 英文摘要
• 全文前言
• 第一部分:脂毒性对胰岛β细胞自身胰岛素信号通路及分泌功能的影响及机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分:大剂量抗氧化剂对高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的影响及机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分:氧化应激-PI3K/Akt通路与高FFA所致的INS-1细胞分泌功能的紊乱
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分:胰岛素信号通路在高游离脂肪酸所致β细胞功能紊乱中的作用及机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 博士期间发表论文及参会情况
• 致谢