焦点粘附激酶在肝癌中表达及其对人肝癌细胞MHCC97-H作用的研究

论文摘要

侵袭转移是影响原发性肝癌预后的最重要因素。焦点粘附激酶（focal adhesion kinase，FAK）在许多肿瘤中高表达，并与肿瘤侵袭转移有关，但FAK与肿瘤预后的关系尚有争议。FAK介导以整合素为主的多条信号传导通路，机制复杂。既然FAK表达与肿瘤关系密切，那FAK是否可作为原发性肝癌的治疗靶点?RNAi技术是后基因时代研究基因功能的重要方法之一。本研究旨在探讨FAK在肝细胞癌中的表达及其在判断预后中的作用，并研究了上调FAK后对人肝癌细胞转移潜能的影响；最后，利用RNAi技术抑制FAK表达以判断FAK是否能成为原发性肝癌治疗靶点。第一部分目的：研究焦点粘附激酶（focal adhesion kinase，FAK）在不同肝细胞癌组织中表达差异及FAK表达在判断肝细胞癌预后中的意义。方法：回顾性分析了我所50例肝细胞癌患者临床资料。用Real-time PCR方法检测肝癌组织、癌周组织和癌栓组织中FAK mRNA表达，免疫组化和Western-blot方法检测FAK蛋白在不同组织中表达和分布；分析FAK mRNA表达与肝细胞癌临床病理指标关系；单因素与Cox回归分析FAK与肝癌预后的关系。结果：FAK mRNA表达在肿瘤组织中为0.229±0.027，明显高于癌周组织的0.163±0.019，且差别有统计学意义（P＜0.001）；癌栓组中癌栓组织FAKmRNA表达水平为0.506±0.155，高于肿瘤组织的0.377±0.176，且差别有显著性意义（P＜0.05）；癌栓组中肿瘤组织FAK mRNA表达0.343±0.05，明显高于无癌栓组中肿瘤组织的0.165±0.025，且差别有统计学意义（P=0.003）；合并肝硬化的癌周组织相对FAK表达为0.191±0.029，高于无肝硬化癌周组织的0.141±0.034，但差别无显著性（P＞0.05）。高侵袭组中肿瘤组织FAK mRNA表达明显高于低侵袭组（0.283±0.038 vs 0.161±0.032，P=0.020）。免疫组化结果示FAK蛋白位于胞浆中，阳性率为50％；Western-blot结果提示癌栓中FAK蛋白表达高于癌组织，而癌组织表达高于癌周组织。FAKmRNA表达与癌栓和侵袭性有关。单因素与Cox回归模型分析发现FAK表达是影响肝细胞癌术后生存率的独立因素。结论：FAK在肝细胞癌发生、发展中有重要作用，FAK表达是判断肝细胞癌预后的独立指标。第二部分目的：观察不同浓度血小板衍生生长因子（PDGF-BB）诱导MHCC97-H细胞中焦点粘附激酶（focal adhesion kinase FAK）表达的动态变化及FAK变化对MHCC97-H细胞转移潜能的影响。方法：不同浓度（1，2.5，5，10，25ng／ml）PDGF-BB诱导MHCC9-H人肝癌细胞，用Real-time RT PCR方法检测FAK及MMP-2的mRNA动态变化，Western-blot方法检测诱导后FAK蛋白表达变化。粘附实验、侵袭实验分别检测诱导后MHCC97-H细胞的粘附、侵袭能力的变化。酶联免疫吸附实验（ABC-ELISA）和明胶酶谱试验检测PDGF-BB诱导后MHCC97-H分泌MMPs变化。激光共聚焦显微镜观察PDGF诱导后MHCC97-H细胞骨架重塑变化。结果：诱导后MHCC97-H细胞FAK mRNA水平均有不同程度上调，在10ng／ml浓度时达到最高，为对照组的112.6倍；诱导后MMP-2 mRNA水平亦有不同程度上调并与FAK mRNA水平上调呈一致性，在10ng／ml浓度时到最高，为对照组的56.9倍。诱导后FAK蛋白表达上调，在10ng／ml组达到高峰。诱导后各组粘附率分别为66±1.84％、69±1.41％、69±2.42％、71±1.37％和66±3.28％，与对照组的54±2.08％比较均有统计学意义（P＜0.001）。诱导后5ng／ml和10ng／ml组侵袭细胞数分别为26.63±1.67和28.75±1.50个，与对照组的21.5±4.0个比较有显著性差异（P＜0.05，P＜0.001）。诱导后粘附率与侵袭细胞数变化在10ng／ml浓度时都达到高峰。诱导后MHCC97-H分泌MMPs明显增加。PDGF-BB诱导5分钟后见丝状伪足，15分钟后见板状伪足，30分钟后见明显粘着斑。结论：PDGF-BB上调MHCC97-H细胞中FAK表达，FAK上调通过细胞骨架重塑和增加MMP-2分泌而促进MHCC97-H细胞的粘附和侵袭能力。第三部分目的：研究特异性FAK siRNA抑制焦点粘附激酶（FAK）表达对MHCC97-H细胞粘附、侵袭和细胞骨架重塑中的作用。方法：利用Lipofectamine 2000将FAK siRNA转染至MHCC97-H细胞。用Real-time PCR和Western-blot方法分别检测RNAi后MHCC97-H细胞中FAK表达。粘附实验、侵袭实验分别检测RNAi后MHCC97-H细胞粘附、侵袭能力变化。酶联免疫吸附实验（ABC-ELISA）和明胶酶谱试验检测RNAi后MHCC97-H细胞分泌MMPs变化。激光共聚焦显微镜观察FAK抑制后免疫荧光标记MHCC97-H细胞骨架构建变化。结果：特异性FAK siRNA在mRNA和蛋白水平均能明显抑制MHCC97-H细胞中FAK表达，阴性对照siRNA不能抑制FAK表达。RNAi作用减少MHCC97-H细胞与细胞外基质粘附，干扰后粘附率为35.8％，低于对照组的57.3％，差异有显著性（P＜0.05）。与正常组的31.3±2.6个细胞相比，抑制FAK后MHCC97-H细胞穿透Tanswell小室的数目减少到14.5±3.1个（P＜0.05）。FAK siRNA抑制FAK后能显著性降低MHCC97-H细胞分泌MMPs。FAK siRNA抑制MHCC97-H细胞FAK表达影响Vinculin在PDGF诱导细胞骨架重塑中分布，阻碍片状伪足形成，延迟粘着斑形成时间。结论：特异性FAK siRNA能明显抑制MHCC97-H细胞中FAK表达；FAK表达下调通过减少MMPs分泌和影响细胞骨架重组而降低MHCC97-H细胞粘附、侵袭能力。

论文目录

• 1.中文摘要
• 2.英文摘要
• 3.前言
• 4.正文
• 第一部分 FAK在不同肝癌组织中表达差异及其与预后的关系
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 上调FAK对MHCC97-H细胞转移潜能作用研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 FAK siRNA敲低FAK对MHCC97-H细胞转移潜能的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论与创新
• 结论
• 创新
• 后续研究工作
• 参考文献
• 5.文献综述
• 6.附件
• 7.致谢