能量代谢在小鼠卵老化中的作用及小鼠胚胎发育的雄性效应研究

论文摘要

第一章能量代谢在小鼠卵老化中的作用停滞在MII期的哺乳动物卵母细胞随着在输卵管或培养液中停留时间的延长而发生老化。老化的卵母细胞受精导致胚胎发育异常,而且卵母细胞老化也不利于体外受精和体细胞核移植等体外卵母细胞操作。在人上,有时一次体外受精失败后需要进行第二次授精,体外培养系统也可能影响到第二次授精的效果。因此有必要研究卵母细胞老化的机理。以前的报道证明卵母细胞老化过程中促成熟因子（maturation promoting factor,MPF）活性下降,从而导致对孤雌激活的敏感性增加,激活率升高。因此,激活率是评价卵母细胞老化程度的重要指标。我们通过向成分简单的CZB培养液中添加葡萄糖、乳酸钠和丙酮酸钠等能量物质,以及添加这些物质代谢途径的特异性抑制剂,研究了小鼠卵母细胞老化过程中能量代谢,为通过改变能量物质调节体外卵母细胞老化提供理论依据:对于优化卵母细胞体外培养条件也有重要意义。我们的实验结果如下:1.卵母细胞在M199+FCS/BSA与CZB+FCS/BSA/PVA中老化情况基本相同,其中去卵丘的卵母细胞（denuded oocyte,DO）在这些培养液中几乎不老化,而卵丘卵母细胞复合体（cumulus-oocytes complex,COC）一半以上发生老化,而且在M199中老化比率更高（74.5%和85%比56%和55%）;DO和COC在M199±PVA培养液中老化模式与以上几组显著不同,其中DO在这两种培养液中发生快速老化,而COC不发生老化。2.在不添加葡萄糖、丙酮酸钠和乳酸钠三种物质的培养液中,DO和COC都发生快速老化,激活率分别为93.3%和91.8%。而在单独添加丙酮酸或者乳酸的培养液中,DO和COC都不发生老化,激活率都低于5%。在单独添加葡萄糖的培养液中,DO发生快速老化,激活率为95.3%,而COC几乎不老化,激活率为0。在添加三种物质或者其中两种的培养液中,DO和COC激活率都很低。3.在含有葡萄糖的CZB培养液中分别添加100μM和200μM的脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone,DHEA）阻断葡萄糖磷酸戊糖通路（pentose phosphatepathway,PPP）发现,COC激活率均小于5%。4.在含有乳酸钠的CZB培养液中添加乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）抑制剂草氨酸钠,随着浓度增加,卵母细胞孤雌激活率逐渐升高;添加10mM和20mM的草氨酸钠激活率分别为49.2%和59.6%。而在含有丙酮酸钠的培养液中添加草氨酸钠不影响卵母细胞激活率。5.在含有丙酮酸钠的CZB培养液中添加不同浓度的线粒体抑制剂鱼藤酮,随着浓度升高,卵母细胞激活率逐渐升高,0.05μM鱼藤酮就有30%卵母细胞能够孤雌激活,当浓度升高到0.1μM时,84.8%的卵母细胞能够孤雌激活。6.在不含有葡萄糖、丙酮酸钠和乳酸钠的CZB培养液中添加不同浓度的巯基乙醇,即使浓度升高到1mM卵母细胞激活率仍然维持在90%以上,显然巯基乙醇不能阻止卵母细胞老化。7.卵母细胞在不含葡萄糖、丙酮酸钠和乳酸钠的CZB培养液中添加不同浓度的二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）,即使浓度升高到500tM激活率仍然维持在90%以上,而且DO在添加500μM二硫苏糖醇的CZB培养液中大部分死亡,只有约20%存活下来,且存活下来的卵母细胞100%发生激活。COC在添加同样浓度的二硫苏糖醇的CZB培养液中不发生死亡。8.卵母细胞在三种CZB培养液中培养24h,其中不添加葡萄糖、乳酸钠和丙酮酸钠的CZB中,80%的卵母细胞发生死亡,存活的卵母细胞100%发生自发激活;而在单独添加乳酸钠的CZB中,卵母细胞老化24h没有发生死亡,但几乎所有卵母细胞（约97%）发生自发激活,而且卵母细胞形态极差,卵母细胞表现为严重畸形和碎裂;单独添加丙酮酸钠的一组卵母细胞保持正常形态,且没有发生激活。以上实验结果说明:1)培养液M199和CZB对卵母细胞老化影响不同。2)卵母细胞在单独添加乳酸钠或者丙酮酸钠的CZB中,DO和COC都不老化:而在单独添加葡萄糖的CZB中DO老化,COC不老化,这说明卵母细胞能够利用乳酸和丙酮酸,但只有通过卵丘细胞才能够利用葡萄糖。3)COC对葡萄糖的利用不是通过PPP途径,抑制PPP途径不会影响卵母细胞在添加葡萄糖的CZB培养液中的老化。4)乳酸必须通过LDH调节生成丙酮酸才能发挥作用,调节卵母细胞老化。5)抑制丙酮酸在线粒体内的代谢,减少ATP的产生会导致卵母细胞老化。6)单独添加巯基乙醇或者二硫苏糖醇不能阻止卵母细胞老化,说明丙酮酸的抗老化作用不是单独通过其抗氧化作用实现的。7)体外长时间（24h）培养卵母细胞,单独添加丙酮酸比单独添加乳酸有更好的抑制卵母细胞老化的作用。第二章小鼠胚胎发育的雄性效应研究虽然成功的胚胎发育依赖于雄性和雌性两方面的遗传和外遗传因素,但雄性对胚胎发育影响的研究却很少。还不清楚通过受精后胚胎发育对卵母细胞进行的评价是否会因不同雄性个体间精子的差异而受影响。本研究首次比较了不同成熟质量的卵母细胞与不同公鼠附睾精子体外受精和Sr2+孤雌激活发育能力之间的差异,并采用随机选择卵母细胞和分别来自附睾尾、输精管或者电射精精子体外受精及发育的方法检测雄性对受精和胚胎发育的影响。结果表明附睾精子和输精管精子受精率和囊胚率显著高于射精精子,但同一公鼠不同次射精精子间差异不显著。平均数和变异系数的标准误分析证明,只要涉及到多只公鼠受精率和受精后的囊胚发育率均显著高于Sr2+孤雌激活后的激活率和囊胚发育率,无论其精子是采自附睾尾、输精管还是射精精子,也不论卵母细胞质量如何。总结如下:（1）同等条件下,小鼠附睾尾精子受精率高于射精精子;（2）和大家畜类似,虽然小鼠被认为在遗传学上差异很小,但在体外生产胚胎上对其发育潜能仍存在显著的雄性效应;（3）孤雌激活用来评价卵母细胞质量更加合适,能够消除雄性效应。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 能量代谢在小鼠卵老化中的作用
• 1.前言
• 1.1 卵母细胞老化概述
• 1.2 卵母细胞激活和排卵后老化
• 2. 材料与方法
• 2.1 体内成熟卵母细胞的获取
• 2.2 卵母细胞孤雌激活
• 2.3 实验设计
• 2.4 数据分析
• 3. 结果
• 3.1 实验一 卵母细胞在M199和CZB中老化
• 3.2 实验二 添加葡萄糖、丙酮酸钠和乳酸钠对老化的作用
• 3.3 实验三 阻断卵母细胞葡萄糖PPP途径对COC老化的影响
• 3.4 实验四 抑制乳酸脱氢酶对卵母细胞老化的影响
• 3.5 实验五 阻断三羧酸循环对卵母细胞老化的影响
• 3.6 实验六 单独添加巯基乙醇对卵母细胞老化的影响
• 3.7 实验七 单独添加二硫苏糖醇对卵母细胞老化的影响
• 3.8 实验八 添加乳酸钠或者丙酮酸钠对卵母细胞长时间老化的影响
• 4. 讨论
• 4.1 不同培养液中卵母细胞老化
• 4.2 葡萄糖代谢与卵母细胞老化
• 4.3 丙酮酸代谢与卵母细胞老化
• 4.4 乳酸代谢与卵母细胞老化
• 4.5 抗氧化物质与卵母细胞老化
• 4.6 还原代谢在小鼠卵母细胞和胚胎中的调节
• 5. 结论
• 6. 参考文献
• 第二章 小鼠胚胎发育的雄性效应研究
• 1.前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 附睾尾和输精管精子获取
• 2.2 电射精精子获取
• 2.3 体内成熟卵母细胞的获取
• 2.4 卵母细胞体外成熟
• 2.5 体外受精
• 2.6 卵母细胞孤雌激活
• 2.7 胚胎培养
• 2.8 实验设计
• 2.9 数据分析
• 3. 结果
• 3.1 实验一:不同条件下成熟的卵母细胞体外受精和孤雌激活
• 3.2 实验二:不同部位获取的精子体外受精
• 3.3 实验三:同一公鼠不同采精次数的精液用于体外受精
• 3.4 实验四:不同公鼠射精精液用于体外受精
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 6. 参考文献
• 致谢
• 作者简介