内切型-β-葡聚糖酶基因的表达

论文摘要

内切型-β-葡聚糖酶（CMC酶）是纤维素酶的重要组分之一,在纤维素水解糖化、食品、饲料、织物水洗等领域中应用广泛。本文采用基因工程技术,在内切型-p-葡聚糖酶基因重组菌株的构建、筛选及产酶等方面进行了研究。首先,以实验室前期克隆得到的厌氧真菌内切型-p-葡聚糖酶基因afl为研究对象,将目的基因与大肠杆菌表达载体pET-28a（+）连接,转入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）,获得重组大肠杆菌BL21 （DE3）/pET-28a（+）-αf1。重组菌的适宜培养条件为：菌体浓度OD600为0.8时加入IPTG至终浓度为0.1 mM,31℃诱导培养。采用SDS-PAGE蛋白电泳对其表达产物进行分析,在40 kDa附近得到与目的基因afl表达蛋白理论值相当的明显条带。酶学性质研究表明,酶蛋白的最适作用条件为pH 6.0,45℃,属于中性纤维素酶。试验结果证明af1基因具有适于表达的完整序列。进一步将af1基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,经限制性内切酶BglⅡ线性化后,采用基因导入仪将重组DNA转入毕赤酵母GS115。在选择性培养平板上进行筛选,挑出六个高抗阳性转化子。提取基因组进行PCR鉴定,均获得与目的基因相关的条带,证明af1基因已整合入GS115基因组,有利于稳定遗传。afl基因在甲醇诱导下可在毕赤酵母中表达,取上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析,在52 kDa附近出现明显条带。分别诱导培养筛选到的六个高抗阳性转化子,发现其产酶性能基本一致。采用重组毕赤酵母在摇瓶条件下分批发酵,结果显示其产酶性能稳定。在pH 6.0,50℃条件下检测CMC酶活力,发酵液中酶活在诱导培养96 h左右可达到600 U/mL以上。该试验结果为进一步利用重组毕赤酵母生产中性纤维素酶奠定了基础。通过试管初筛、摇瓶复筛,从各约300个里氏木霉转化子T/af1（含有厌氧真菌内切型-p-葡聚糖酶基因afl）和T/egll（含有里氏木霉内切型-p-葡聚糖酶基因egⅡ）中获得了T/αf1-3和T/egⅡ-5两个优良转化子。对重组里氏木霉T/af1-3进行摇瓶产酶研究,在pH 6.0,50℃条件下测得发酵液中的中性CMC酶活力可达1280 U/mL,提高到同期原始菌的3.9倍；而对重组里氏木霉T/egⅡ-5进行摇瓶产酶研究,在pH 4.8,50℃条件下测得发酵液中的酸性CMC酶活力可达到3500 U/mL,约是同期原始菌的4.9倍。采用里氏木霉作为基因工程宿主菌具有外源基因表达水平高,产物易于分离提取等优点,本文的研究成果在纤维素酶的定向进化及纤维素酶高产菌株的构建方面具有重要的指导意义。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 概述
• 1.2 内切型-β-葡聚糖酶基因的研究进展
• 1.2.1 国内相关成果
• 1.2.2 国外研究现状
• 1.3 β-葡聚糖酶的应用及展望
• 1.3.1 在啤酒工业中的应用
• 1.3.2 在饲料工业中的应用
• 1.3.3 在纺织工业中的应用
• 1.4 基因表达系统的相关研究
• 1.4.1 大肠杆菌表达系统
• 1.4.2 毕赤酵母表达系统
• 1.4.3 丝状真菌表达系统
• 1.5 本研究思路及意义
• 2 厌氧真菌内切型-β-葡聚糖酶基因af1在大肠杆菌中的表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 质粒与菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 菌株培养
• 2.1.4 重组质粒的构建与验证
• 2.1.5 重组质粒在大肠杆菌中的表达产物分析
• 2.1.6 表达产物的最适作用条件研究
• 2.1.7 重组大肠杆菌表达条件的优化及摇瓶产酶试验
• 2.1.8 菌体浓度测定
• 2.1.9 内切型-β-葡聚糖酶（CMC酶）活力的测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 原核表达质粒的构建
• 2.2.2 重组质粒鉴定分析
• 2.2.3 af1基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达
• 2.2.4 af1基因表达产物AF1-1蛋白的最适作用条件
• 2.2.5 重组大肠杆菌表达条件的优化
• 2.2.6 重组大肠杆菌的摇瓶产酶试验
• 2.3 小结
• 3 厌氧真菌内切型-β-葡聚糖酶基因af1在毕赤酵母中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 质粒与菌株
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 培养基与菌株培养条件
• 3.1.4 重组质粒的构建及验证
• 3.1.5 毕赤酵母的电转化
• 3.1.6 重组毕赤酵母的筛选
• 3.1.7 重组毕赤酵母的基因组提取
• 3.1.8 基因组PCR
• 3.1.9 重组毕赤酵母的诱导培养
• 3.1.10 af1基因在毕赤酵母GS115中的表达
• 3.1.11 菌体浓度及细胞数量测定
• 3.1.12 CMC酶活力的测定方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 毕赤酵母表达载体的构建及验证
• 3.2.2 重组毕赤酵母的筛选、鉴定
• 3.2.3 重组毕赤酵母表达产物的分析
• 3.2.4 重组毕赤酵母的诱导表达
• 3.3 小结
• 4 重组里氏木霉产内切型-β-葡聚糖酶的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株与试剂
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 重组转化子的试管筛选
• 4.1.4 重组转化子的摇瓶筛选
• 4.1.5 菌株的摇瓶发酵培养
• 4.1.6 分析检测方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 重组里氏木霉的初筛
• 4.2.2 重组里氏木霉的复筛
• 4.2.3 重组里氏木霉T/af1-3的产酶进程研究
• 4.2.4 重组里氏木霉T/egⅡ-5的产酶进程研究
• 4.2.5 重组里氏木霉T/af1-3与重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-af1产酶性能的比较
• 4.2.6 重组里氏木霉T/af1-3与T/egⅡ-5产酶性能的对比分析
• 4.3 小结
• 5 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 附录:论文发表情况