GL-7-ACA酰化酶基因工程菌的发酵工艺优化及酶工程研究

论文摘要

GL-7-ACA酰化酶（EC．3．1．5．11）是两步酶法催化CPC生产7-ACA的重要工业用酶之一，它的表达量和酶活性的增加是提高7-ACA产量的前提。重组大肠杆菌E. coliBL21（DE3）pYW-GA表达GL-7-ACA酰化酶呈组成型表达，其高效表达的关键技术是补料策略。本文探索了组成型重组大肠杆菌E.coliBL21（DE3）pYW-GA高效表达的发酵工艺。在摇瓶培养获得GL-7-ACA酰化酶工程菌的最佳发酵条件的基础上，用5L自控式发酵罐进行分批补料培养。为了减少基因工程菌代谢过程中乙酸的积累，使GL-7-ACA酰化酶基因获得高效表达，发酵过程中采用不同的流加方式进行补料，同时对转速和溶氧等进行控制。考察了恒速流加、pH反馈流加和指数流加三种补料模式，比较得出菌浓最高的是pH8.0反馈流加这一模式，OD600可达35，而酶活最高的模式是pH7.0反馈流加，最高酶活可达3463.8U／L。固定化金属亲和层析技术以其分离蛋白专一性强而得到广泛应用，本文以EIP-ARG-IDA-Co2+为载体，从可溶性总蛋白中一步分离纯化具有His-tag标签的GL-7-ACA酰化酶。在此基础上进行了固定化方面的研究，确定固定化最适条件是150～200U／g给酶量与载体比，固定化时间16h，固定化介质pH7.0。固定化酶的最适反应温度为50℃，最适反应pH为8.0。同时还考察了固定化酶的热稳定性，重复利用性及载体的重复使用等特性。大肠杆菌E.coliBL21（DE3）pYW-GA高效表达GL-7-ACA酰化酶的发酵工艺及其固定化方法的建立为工业化生产GL-7-ACA酰化酶和两步酶法生产7-ACA奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 头孢菌素类抗生素研究背景
• 1.1.1 头孢菌素类抗生素概况
• 1.1.2 头孢菌素的作用机理
• 1.1.3 头孢菌素的结构及其修饰
• 1.1.4 国内外头孢菌素类抗生素市场状况
• 1.2 7-ACA生产概况
• 1.2.1 化学法生产7-ACA工艺及其特点
• 1.2.2 酶法生产7-ACA工艺及其特点
• 1.2.3 我国7-ACA生产现状
• 1.3 GL-7-ACA酰化酶
• 1.3.1 GL-7-ACA酰化酶来源及分类
• 1.3.2 GL-7-ACA酰化酶结构和性质
• 1.3.3 GL-7-ACA酰化酶国内外研究进展
• 1.4 重组菌高密度发酵
• 1.4.1 乙酸对重组大肠杆菌生长及外源基因表达的影响
• 1.4.2 高密度发酵补料调控策略
• 1.5 固定化酶概述
• 1.5.1 酶的固定化方法
• 1.5.2 固定化酶的应用
• 1.6 固定化金属亲和层析
• 1.6.1 亲和层析概述
• 1.6.2 固定化金属亲和层析原理
• 1.6.3 金属螯合载体的构成与层析标签
• 1.6.4 金属螯合载体的优缺点及应用
• 1.6.5 固定化金属亲和层析技术其他方面的应用
• 1.7 本论文选题意义与研究内容
• 1.7.1 选题意义
• 1.7.2 工作内容
• 第2章 摇瓶分批发酵条件优化
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 温度对发酵的影响
• 2.2.2 pH对发酵的影响
• 2.2.3 初始葡萄糖浓度对E.coliBL21（DE3）pYW-GA产酶的影响
• 2.2.4 初始乙酸的抑制和同化作用
• 2.3 小结
• 第3章 5L自控式发酵罐分批发酵工艺优化
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 5L发酵罐恒速流加模式
• 3.2.2 5L发酵罐pH反馈流加模式
• 3.2.3 5L发酵罐指数流加模式
• 3.3 小结
• 第4章 GL-7-ACA酰化酶的纯化与固定化
• 引言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 酶的纯化
• 4.2.2 纯化效果
• 4.2.3 不同酶量与载体比对固定化效果的影响
• 4.2.4 反应体系不同pH对固定化效果的影响
• 4.2.5 不同固定化时间对固定化的影响
• 4.3 小结
• 第5章 固定化GL-7-ACA酰化酶的酶学特性
• 引言
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 固定化酶的最佳反应温度
• 5.2.2 固定化酶的最适反应pH值
• 5.2.3 固定化酶的热稳定性
• 5.2.4 固定化酶和游离酶的米氏常数测定
• 5.2.5 固定化酶的操作稳定性
• 5.2.6 载体的再生
• 5.3 小结
• 第6章 绪论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 附录A 实验主要仪器及试剂
• 附录B 7-ACA标准曲线
• 附录C 蛋白质标准曲线
• 附录D 缩略语（Abbreviations）
• 攻读学位期间的研究成果