肠出血性大肠杆菌O157：H7单克隆抗体及胶体金免疫层析试纸条的研制

论文摘要

肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)0157：H7是一种重要的食源性病原菌,1982年该菌首先在美国被发现,此后在世界各地散发或地方流行。该菌感染可引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)、血栓性血.小板减少性紫癜(TTP)等全身性并发症。反刍动物是EHEC O157:H7的三要贮存宿主,国内外均有从牛羊等动物的粪便中分离到该菌的报道,目前普遍认为受污染的环境、食物和水源是本病的主要传播媒介。建立和完善动物性食品及环境中EHEC O157:H7的检测手段,是进行流行病学调查以及该病防控的关键问题之一。虽然分离培养鉴定仍是检测EHEC0157：H7的金标准,但通常需要数天才能得到结果,不能满足快速诊断的需要。分子生物学和免疫学方法因具有特异、敏感、快速等特点在EHEC O157:H7检测和诊断中发挥着愈来愈重要的作用。研究一：将E. coli0157：H7用甲醛灭活,免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了5株能稳定分泌抗E. coli0157：H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为181、2D6、2D9、2E3和2G5。其中2G5的Ig亚类为IgG3,其余四株均为IgM,轻链均为K型,腹水抗体ELISA效价分别为1×105、1×104、1×106、1×107、1×107,凝集试验显示五株单抗与EHEC O26:H11、 EHEC O111等其他受试菌株均不反应,具有良好的特异性。研究二：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,用纯化的单克隆抗体2G5标记,制备金标抗体玻璃纤维素膜；将纯化的2E3固定于硝酸纤维素膜(NC)上作为捕获抗体；组装成双抗夹心法O157：H7胶体金免疫层析检测试纸条。用该试纸条可特异检测O157：H7,敏感度为106CFU/ml,在1～5min内可得出检测结果,与EHECO26：H11、EHEC O111等其他受试菌株均不反应；敏感性高,特异性强,便于O157：H7的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。研究三：采用灌胃攻毒方式,使小鼠感染O157：H7,用大肠杆菌157检测试纸条与O157：H7鉴别培养基细菌培养计数两种方法检测感染小鼠粪便中的O157：H7的排菌量和排菌持续时间。结果显示小鼠在感染O157：H7后2h开始粪便排菌,6h达到峰值,排菌时间最长可持续15d。大肠杆菌O157检测试纸条与O157：H7鉴别培养基细菌培养计数两种方法的检测结果一致,试纸条更简便、快捷、直观,在1～5min内可得出检测结果,便于O157：H7临床样品的快速检测以及粪便、食品、环境污染物、水样等现场检测样品中O157：H7的快速筛查。本实验为O157：H7流行病学、致病机理和防控研究提供了动物模型和检测手段。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 文献综述
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 致病机理
• 4 临床特征
• 5 毒力因子
• 5.1 志贺毒素
• 5.2 紧密粘附素
• 5.3 溶血素
• 5.4 外膜蛋白
• 5.5 脂多糖
• 5.6 菌毛
• 5.7 其他相关因子
• 6 EHEC O157:H7的检测方法
• 6.1 细菌分离法
• 6.2 血清学检测方法
• 6.3 免疫学检测方法
• 6.4 分子生物学检测方法
• 7 防控策略
• 7.1 消灭传染源
• 7.2 切断传播途径
• 7.3 免疫预防
• 研究一 分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 动物和细胞株
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器
• 2 方法
• 2.1 抗原的制备
• 2.2 杂交瘤细胞株的建立
• 3 结果
• 3.1 杂交瘤细胞系的建立
• 3.2 腹水纯化
• 3.3 抗体效价
• 3.4 类测定
• 3.5 凝集试验
• 4 讨论
• 研究二 大肠杆菌O157:H7单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 胶体金溶液的制备
• 2.2 免疫胶体金的制备
• 2.3 胶体金免疫层析试纸条的制备
• 2.4 胶体金免疫层析检测试纸条成品检验
• 3 讨论
• 研究三 大肠杆菌O157:H7人工感染小鼠排菌动态检测
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 感染鼠的临床症状
• 2.2 感染鼠的排菌动态
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录