CpG-ODN的免疫增强功能和安全性研究

论文摘要

目的通过将乙肝表面抗原和CpG-ODN单独或联合免疫BAL b/c小鼠,观察小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平及其脾脏的组织形态学改变,评价CpG-ODN在小鼠全身和脾脏局部产生的免疫学效应,探讨CpG-ODN的免疫增强功能和可能的安全性问题;并进一步体外观察经乙肝表面抗原与CpG-ODN单独或联合体外刺激后小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性的动态改变,评价CpG-ODN对乙肝表面抗原的免疫增强功能,进而探讨CpG-ODN是否可以作为乙肝表面抗原的免疫佐剂。方法将CpG-ODN质粒转化大肠杆菌DH5α,涂布于氨苄平板37℃培养,挑取若干菌落于37℃小量液体培养,碱裂解法抽提质粒,酶切电泳鉴定;将鉴定成功菌落扩大培养,用去内毒素质粒大量抽提试剂盒抽提质粒,紫外分光光度法鉴定质粒的含量和纯度。BAL b/c小鼠随机分成五组:HBsAg和高剂量CpG-ODN联合免疫组、HBsAg与CpG-ODN中剂量组、HBsAg和低剂量CpG-ODN联合免疫组、HBsAg单用组和生理盐水对照组,分别于第0、2、4周免疫BAL b/c小鼠。于第1-8周断尾采血,ELISA法检测小鼠外周血中HBsAb和IFN-γ的水平;于第9周取脾,分离小鼠脾淋巴细胞,并分别用ConA和HBsAg体外刺激培养24h,XTT/PMS法检测小鼠脾淋巴细胞增殖活性;同时制备小鼠脾脏组织的石蜡切片,HE染色法观察小鼠脾脏组织形态学改变。通过设立ConA组、HBsAg组、HBsAg与CpG-ODN联用组、HBsAg与pUC18联用组、CpG-ODN组、pUC18组、细胞空白对照及培养基空白对照组, XTT/PMS法评价HBsAg和/或CpG ODN对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果CpG-ODN质粒的含量为3.75mg,OD260/OD280比值为1.77。HBsAg和高剂量CpG-ODN联合免疫组、HBsAg和中剂量CpG-ODN联合免疫组、HBsAg和低剂量CpG-ODN联合免疫组的HBsAb水平均显著高于HBsAg单用组（p<0.05）;HBsAg和高剂量CpG-ODN联合免疫组、HBsAg和中剂量CpG-ODN联合免疫组的IFN-γ水平和脾淋巴细胞增殖活性均显著高于HBsAg单用组和生理盐水对照组（p<0.05）。HE染色提示,与HBsAg单用组和生理盐水对照组相比,HBsAg和高剂量CpG-ODN联合免疫组、HBsAg和中剂量CpG-ODN联合免疫组、HBsAg和低剂量CpG-ODN联合免疫组的小鼠脾脏的白髓、红髓界限清晰,白髓中的动脉周围淋巴鞘增厚,脾小体数量增多,体积增大,脾小体可见明显的生发中心;红髓充血明显,脾索和脾血窦界限模糊。相对而言,HBsAg和CpG-ODN高、中剂量组的小鼠脾脏的动脉周围淋巴鞘较厚,脾小体体积较大,而HBsAg和低剂量CpG-ODN联合免疫组小鼠脾脏红髓充血较为明显。HBsAg和高剂量CpG-ODN联合免疫组的小鼠脾脏组织结构尚清晰完整,未观察到脾小体结构形态的异常。XTT/PMS检测发现,CpG-ODN最适终浓度是5-10μg/mL;最适刺激培养时间为72h。结论CpG-ODN可以明显地提高小鼠产生针对乙肝表面抗原的体液免疫和细胞免疫应答水平;高剂量的CpG-ODN冲击并未诱发小鼠脾脏产生严重的免疫损伤;CpG-ODN能够显著增强HBsAg对小鼠脾脏淋巴细胞的刺激作用,可以作为乙肝表面抗原有效的免疫佐剂。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 CpG-ODN 质粒的大量抽提及鉴定
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 质粒和菌株
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 感受态细胞制备
• 2.2.2 质粒转化
• 2.2.3 转化菌的小量液体培养和质粒抽提
• 2.2.4 质粒酶切鉴定
• 2.2.5 质粒的大量制备
• 2.2.6 紫外分光光度法测定质粒的含量和纯度
• 3 结果
• 3.1 CpG-ODN 质粒的酶切鉴定
• 3.2 质粒的产量和纯度
• 第二部分 CpG-ODN 对乙肝表面抗原免疫效果影响的研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 动物分组及免疫方案
• 2.2.2 检测方案
• 3 结果与分析
• 3.1 小鼠外周血HBsAb 的水平检测
• 3.1.1 小鼠免疫后第7-28 天外周血中HBsAb 的平均滴度变化
• 3.1.2 小鼠免疫后第3-8 周外周血中HBsAb 的平均滴度变化
• 3.2 小鼠外周血IFN-γ的水平检测
• 3.3 小鼠脾淋巴细胞增殖活性检测
• 3.4 小鼠脾脏组织形态学观察
• 4. 讨论
• 第三部分 CpG-ODN 增强 HBsAg 对小鼠脾淋巴细胞刺激作用的研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 实验分组
• 2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞分离
• 2.2.3 XTT/PMS 法小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性
• 2.2.4 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 检测结果
• 3.1.1 第24h 小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性结果
• 3.1.2 第48h 小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性结果
• 3.1.3 第72h 小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性结果
• 3.1.4 第96h 小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性结果
• 3.2 结果分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录一 英文缩略词表
• 附录二 文献综述
• 附录三 攻读学位期间发表的论文
• 致谢