论文摘要
脓毒症是感染因素介导的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）,是烧伤、创伤和感染性疾病患者的常见并发症。流行病学资料显示,每年全球有超过1800万的脓毒症病例,且患者数目每年以1.0%速度递增。重症脓毒症和脓毒性休克是重症监护病房（intensive care units, ICU）病人死亡的首要因素,死亡率高达50%-60%。内毒素（endotoxin/Lipopolysaccharide, LPS）是G-菌外膜的主要成分,是介导细菌脓毒症的重要病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）。LPS进入机体内后,首先与内毒素结合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein,LBP）结合,在LBP的作用下,LPS与单核/巨噬细胞膜上的受体CD14结合形成LPS-CD14复合物,复合物中的LPS与跨膜受体TLR4（Toll like receptor 4,TLR4）结合,将信号转入胞内,导致靶细胞的活化,释放TNF-α、IL-6等炎症介质,介导脓毒症的发生。尽管对脓毒症的病理生理机制及其防治策略的研究较为深入,但至今仍无特殊有效的药物供临床治疗。中草药在脓毒症中的应用具有悠久的历史,已证实多种中草药具有较好的拮抗内毒素作用,但由于中药成分复杂,加之缺乏有效的分离检测手段,限制了中草药在脓毒症防治中的应用与发展。在前期的研究中,我们将LPS的活性中心Lipid A包被于生物传感器上,建立了以Lipid A为靶点的筛选拮抗LPS药物的实验平台。基于此技术平台,本研究采用大孔吸附树脂、超滤膜分离和高效液相色谱（high performance liquid chromatogram, HPLC）技术,对中药水提液进行多级分离纯化,以期从天然药物中获取具有拮抗LPS活性的单体化合物,为脓毒症防治药物的研发提供新的思路和方法。方法1.应用以Lipid A为靶点的生物传感器技术平台,检测60种中药水煎液与Lipid A的结合活性;对明确具有与Lipid A结合活性的中药,采用大孔吸附树脂分离技术、超滤膜技术和HPLC技术进行分离提取,应用生物传感器进行活性追踪监测,收集能与Lipid A结合的组分,并对其进行针对LPS的体内外生物学活性评估。对活性明确的有效组分,用HPLC作进一步的分离纯化,选择与Lipid A具有较高结合活性的HPLC产物作进一步的研究,对所得单体化合物进行纯度分析和结构解析。2.对得到的单体化合物进行针对细菌脓毒症的体内外生物学活性评价,包括:①鲎试剂法检测单体对LPS的体内外中和作用;②ELISA法检测单体对LPS刺激巨噬细胞产生细胞因子（TNF-α和IL-6）的抑制作用;③RT-PCR法检测单体对LPS诱导巨噬细胞TLR4和TNF-αmRNA表达的影响;④观察单体化合物对脓毒症模型小鼠的保护作用。结果1.应用生物传感器技术平台,从60种中药中筛选出黄芩、胡连、赤芍、五倍子、诃子等5种具有与Lipid A较高结合活性的中药（RU>200 arc seconds）。以黄芩为研究对象,从黄芩水提液中分离出与Lipid A具有结合活性的组分SbG-4;SbG-4 （40mg/kg）能显著提高热灭活大肠埃希氏菌攻击小鼠72h的存活率;物质属性鉴定SbG-4为黄酮类物质。应用膜分离技术从SbG-4中分离出分子量小于5000Da的5KL,5KL经HPLC分离获得5个HPLC组分（5KL-1～5）;在5个组分中,以5KL-1与Lipid A的结合活性最高;在体外5KL-1对LPS具有直接中和作用、可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放TNF-α,体内评价显示5KL-1对脓毒症模型小鼠具有显著的保护作用;5KL-1经HPLC进一步分离后,得到5KL-1A、5KL-1B和5KL-1C三个产物;其中仅5KL-1B是单一物质并与Lipid A的结合活性最高,纯度分析显示,5KL-1B的纯度因子为999.685;经质谱、核磁、红外等波谱分析,对5KL-1B的结构指认为2’, 5, 6’, 7-四羟基二氢黄酮醇（2’, 5, 6’, 7-tetrahydroxy-flavanonol, THF）,分子式为:C15H12O7。2.对THF的活性研究显示:①、THF在体内外对LPS均具有直接中和作用;②、THF能够显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6,并具有明显的量效关系;③、THF对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4和TNF-α在mRNA水平的表达均具有显著的抑制作用;④、THF对致死剂量热灭活大肠埃希氏菌攻击的小鼠具有显著的保护作用。结论应用现代生物技术从黄芩中定向分离出2’, 5, 6’, 7-四羟基二氢黄酮醇;2’, 5, 6’, 7-四羟基二氢黄酮醇在体内外对LPS均具有拮抗作用,对脓毒症模型小鼠具有保护作用。
论文目录
相关论文文献
- [1].植物二氢黄酮醇-4-还原酶基因的研究进展[J]. 南方农业 2016(21)
- [2].茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆、表达及功能分析[J]. 茶叶科学 2013(03)
- [3].植物二氢黄酮醇4-还原酶基因的研究进展[J]. 生物技术通讯 2009(03)
- [4].植物二氢黄酮醇4-还原酶的生物信息学分析[J]. 江苏农业科学 2014(06)
- [5].洋葱二氢黄酮醇-4-还原酶基因的分子克隆[J]. 山东农业科学 2010(02)
- [6].3种荞麦作物二氢黄酮醇4-还原酶生物信息学分析[J]. 西安文理学院学报(自然科学版) 2017(04)
- [7].2',5,6',7-四羟基二氢黄酮醇对内毒素诱导巨噬细胞活化的影响[J]. 解放军药学学报 2011(05)
- [8].苦荞二氢黄酮醇4-还原酶的原核表达与多克隆抗体制备[J]. 西北植物学报 2015(05)
- [9].黄芩药材中2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇的分离与鉴定[J]. 中国药房 2010(03)
- [10].二氢黄酮醇-4-还原酶在花青素合成中的功能及调控研究进展[J]. 西北植物学报 2018(01)
- [11].二氢黄酮醇-4-还原酶基因的结构与功能研究[J]. 安徽农业科学 2011(26)
- [12].芜菁二氢黄酮醇4–还原酶基因的克隆与功能鉴定[J]. 园艺学报 2014(04)
- [13].美国红枫变色期二氢黄酮醇还原酶和类黄酮糖基转移酶变化研究[J]. 山东林业科技 2008(06)
- [14].桑树二氢黄酮醇-4-还原酶和花青素合酶基因在桑椹中的表达谱及其与花青素含量的关系[J]. 蚕业科学 2019(06)
- [15].高等植物二氢黄酮醇4-还原酶基因研究进展[J]. 植物研究 2018(04)
- [16].芥菜型油菜4-二氢黄酮醇还原酶基因的克隆和表达分析[J]. 作物学报 2008(01)
- [17].皂角刺的高效液相指纹图谱分析及多组分测定[J]. 中草药 2017(07)
- [18].牡丹二氢黄酮醇4-还原酶基因PsDFR1的克隆及表达分析[J]. 植物生理学报 2011(09)
- [19].紫花苜蓿二氢黄酮醇还原酶基因(MsDFR)的克隆与分析[J]. 草业学报 2012(02)
- [20].HPLC法测定黄芩中2′,5,6′,7-四羟基二氢黄酮醇的含量[J]. 中国药房 2009(36)
- [21].毛白杨二氢黄酮醇-4-还原酶基因PtDFR的克隆和特性分析[J]. 中国细胞生物学学报 2020(06)
- [22].二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)基因在烟草中的过量表达[J]. 山西农业科学 2012(06)
- [23].芒果二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的克隆及其表达分析[J]. 分子植物育种 2015(04)
- [24].2’,5,6’,7-四羟基二氢黄酮醇对内毒素刺激巨噬细胞ST2 mRNA表达的影响[J]. 北京医学 2010(05)
- [25].茶叶二氢黄酮醇还原酶/无色花青素还原酶反应产物的快速检测方法研究[J]. 中国农学通报 2008(06)
- [26].3种小麦作物二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)基因的生物信息学分析[J]. 中国农学通报 2014(06)
- [27].毛白杨二氢黄酮醇合酶基因PtDFR1的克隆与功能验证[J]. 分子植物育种 2012(03)
- [28].广西产黄杞叶不同溶媒提取物中二氢黄酮醇的定量分析[J]. 天然产物研究与开发 2014(08)
- [29].荔枝DFR基因的克隆及其序列分析[J]. 福建农林大学学报(自然科学版) 2013(05)
- [30].杨树二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)的克隆及反义表达对儿茶素合成的影响[J]. 东北林业大学学报 2016(10)
标签：四羟基二氢黄酮醇论文; 脓毒症论文; 内毒素论文;