论文摘要
目的探索胰腺癌中医"证"与病机可能的关系,探寻清胰化积方（QYHJ）治疗胰腺癌的可能作用机制。方法第一部分1、建立不同中医证型（脾虚型、湿热型和血瘀型）pancO2胰腺癌皮下移植瘤模型,评价不同证型对肿瘤生长的影响。2、建立不同中医证型（脾虚型、湿热型和血瘀型）pancO2胰腺癌皮下移植瘤模型,观察不同证型胰腺癌对抗胰腺癌中药QVHJ治疗的反应性。第二部分1、采用real-time PCR和western blot检测QYHJ治疗后胰腺肿瘤细胞SKImRNA和蛋白的表达变化。2、采用Real-time PCR对SKI mRNA在四种人胰腺癌细胞系SW1990、BxPC3、PANC-1和PC3中的差异性表达进行半定量分析。3、采用RT-PCR技术,检测SKI相关TGF-β信号通路关键分子mRNA在四种人胰腺癌细胞系SW1990、BxPC3、PANC-1和PC3中的表达。4、设计针对SKI基因cds区的Negative、siRNA1、siRNA2、siRNA3序列,设计合成互补单链DNA片段,以H1启动子后的BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）为插入位点,克隆进真核表达载体pSIH1-H1-copGFPshRNA Vector,重组载体PCR扩增回收及DNA序列分析进行鉴定。5、应用脂质体转染方法将重组载体pSIH-negative和pSIH-siRNA分别导入293T细胞,Real-time PCR筛选有效的SKI干扰序列。6、参照SBI Lentivector Expression System操作手册,包装产生含有pSIH-siRNA3和pSIH-negative穿梭质粒的假病毒颗粒,分别感染SW1990和BxPC3细胞,建立干扰SKI基因的稳定细胞株以及对照细胞株。7、通过Real-time PCR和Western blot方法对细胞RNAi后SKI表达情况进行鉴定。8、WST（water-soluble tetrazolium salt）法测定SKI RNAi对人胰腺癌细胞体外增殖的影响,并绘制细胞增殖曲线。9、标准PI染色流式细胞计数法（flow cytometry,FCM）检测SKI RNAi对人胰腺癌细胞细胞周期分布的影响。10、体外运动实验（wound healing assay）检测SKI RNAi对人胰腺癌细胞运动能力的影响。11、体外侵袭实验（transwell）检测SKI RNAi对人胰腺癌细胞体外侵袭能力的影响。12、建立裸鼠皮下移植瘤模型,探讨SKI RNAi对人胰腺癌细胞体内肿瘤生长的影响。13、通过尾静脉注射人胰腺癌细胞,探讨SKI RNAi对人胰腺癌细胞体内肝转移的影响。14、RT-PCR和real-time PCR检测SKI RNAi后TGFβ信号通路下游反应性靶基因PAI-1 mRNA和CTGF mRNA的表达,同时观检测其他下游反应性靶基因表达情况。15、RT-PCR检测SKI RNAi后TGF-β信号通路关键分子TβRⅡ、TβRI、smad2、3、4、7的表达情况,以及通过western blot检测smad3磷酸化水平。16、Real-time PCR检测与细胞增殖、侵袭、转移相关基因表达的变化。17、流式细胞仪检测TGFB信号通路阻断后SKI RNAi对细胞周期分布的影响。18、体外侵袭实验检测TGFβ信号通路阻断后SKI RNAi对细胞侵袭能力的影响。19、建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型,评价SKI不同表达人胰腺癌细胞对QYHJ治疗的反应性。结果第一部分1、不同的中医证型pancO2细胞体内成瘤率均为100%,但三模型组肿瘤生长速度均要低于对照组,尤其湿热组表现明显（瘤重与对照组比较,下降了31.7%）。2、脾虚组与湿热组肿瘤在应用QYHJ治疗后肿瘤体积与瘤重均有降低。血瘀组肿瘤体积与瘤重在应用QYHJ后并没有表现出明显的抑瘤作用。第二部分l、经QVHJ治疗后SW1990人胰腺癌细胞SKI mRNA和蛋白表达量与未经QYHJ治疗比较,分别下降了39.6%和41.3%。2、SKI在四种人胰腺癌细胞中均有表达,其中BxPC3、PANC-1和PC3细胞SKI mRNA表达量分别是SW1990细胞的0.9、1.4和0.7倍。3、SKI相关TGFβ信号通路关键分子TβRⅠ、TβRⅡ、smad2、smad3、smad7在四种人胰腺癌细胞系（SW1990、BxPC3、PANC-1和PC3）均有表达,除外smad4在BxPC3中不表达、TβRⅡ在PC3中不表达。4、重组载体pSIH-negative pSIH-siRNAl、pSIH-siRNA2和pSIH-siRNA3经PCR扩增回收电泳及DNA测序证明其序列的正确性。5、Real-time PCR检测发现转染pSIH-siRNAl、pSIH-siRNA2和pSIH-siRNA3细胞SKI mRNA表达水平分别是转染pSIH-negative细胞的55.0%、54.0%和45.0%,我们选择pSIH-siRNA3和pSIH-negative进行后续实验。6、包装产生含有pSIH-siRNA3和pSIH-negative穿梭质粒的假病毒颗粒,分别感染SW1990和BxPC3细胞,建立干扰SKI基因的稳定细胞株（SW1990/SKIRNAi和BxPC3/SKI RNAi）以及对照细胞株（SW1990/con RNAi和BxPC3/con RNAi）。7、SW1990/con RNAi和SW1990/SKI RNAi细胞SKI mRNA表达水平分别是亲代细胞的105%和46%,SKI蛋白表达水平分别是亲代细胞的123%和30%:BxPC3/con RNAi和BxPC3/SKI RNAi细胞SKI mRNA表达水平分别是亲代细胞的94%和38%,SKI蛋白表达水平分别是亲代细胞的90%和16%。8、SKI RNAi增加了SW1990和BxPC3细胞对TGF-D1的敏感性,两种人胰腺癌细胞在不同浓度TGF-β1（0、25、50、100、200、300pM）的诱导下,细胞体外增殖明显减慢。9、SKI RNAi后细胞经TGF-β1诱导,GO-G1期细胞比列明显增加,在SW1990细胞中由原来的40.4%上升到62.9%（P＜0.05）;在BxPC3细胞中由原来的20.0%上升到66.6%（P＜0.05）。10、在TGF-β1诱导下,SW1990和BxPC3细胞体外运动能力明显增强,但SW1990/SKI RNAi细胞经TGFBl诱导24小时后,与SW1990/con RNAi细胞相比,伤口面积降低了54.3%（P＜0.05）;BxPC3/SKI RNAi细胞经TGFβ1诱导12小时后,与BxPC3/con RNAi细胞相比,伤口面积降低了57.2%（P＜0.05）。11、在TGF-β1诱导下,SW1990和BxPC3胞体外侵袭能力明显增强,但SW1990/SKI RNAi细胞经TGFβ1诱导48小时后,与SW1990/con RNAi细胞相比,侵袭细胞数增加了36.3%（P＜0.05）;BxPC3/SKI RNAi细胞经TGFβ1诱导24小时后,与BxPC3/con RNAi细胞相比,侵袭细胞数增加了43.3%（P＜0.05）。12、裸鼠皮下移植瘤在SKI RNAi后生长明显减慢,SW1990在接种后d31时肿瘤平均体积和瘤重分别下降至对照组的55.8%（P＜0.01）和58.4%（P＜0.05）;BxPC3在接种后8周时肿瘤平均体积和瘤重分别下降至对照组的53.7%（P＜0.01）和46.7%（P＜0.05）。13、细胞经尾静脉注射后后4周BxPC3、BxPC3/con RNAi和BxPC3/SKI RNAi组肝脏转移发生率分别为83.3%（5/6）、71.4%（5/7）和100%（6/6）,而平均肝脏转移灶数目分别为15.8、18.0和43.6,BxPC3/SKI RNAi与BxPC3/con RNAi组比较,增加了1.4倍（P＜0.01）。SW1990、SW1990/conRNAi和SW1990/SKI RNAi细胞在尾经脉注射后两月均未发现有肝脏转移。14、SW1990和BxPC3细胞在SKI RNAi后PAI-1和CTGF mRNA表达量明显上升,而且维持时间延长;同时伴有c-jun、JunB、p21 mRNA的表达上调和c-myc、CDC25A mRNA表达下调。15、SKI RNAi并不会对TβRⅡ、TβRⅠ、smad2、3、4、7的表达产生影响,但在SKIRNAi后磷酸化smad3水平明显增加。16、SKI RNAi在体内、外上调p21、MMP-2、MMP-9和VEGF,同时下调CyclinD1的表达（均P＜0.05）。17、TβRI/ALK5激酶抑制剂SB431542可阻断SKI RNAi后TGF-β诱导的G1期阻滞。18、TpRFALK5激酶抑制剂SB431542可阻断SKI RNAi后TGF-β诱导的促侵袭作用。19、SW1990裸小鼠皮下移植瘤给予QYHJ治疗后瘤重抑制率为29.6-32.2%,但SKI RNAi后SW1990裸小鼠皮下移植瘤予QYHJ治疗后瘤重抑制率为16.0%。结论1、胰腺癌证与瘤之间可能是一种因瘤致证的关系,证的存在是机体对肿瘤存在所表现出的一种反应,因此要针对胰腺癌本质病机的治疗。2、SKI下调在体内外具有抑制肿瘤生长作用,该作用的发挥主要通过影响smad3磷酸化、进而增强TGF-β转录活性的诱导作用,恢复胰腺癌细胞对TGF-β诱导细胞周期阻滞作用的反应性来实现的,QYHJ可通过下调SKI表达抑制了胰腺肿瘤的生长,SKI可能是QYHJ治疗胰腺癌的一个重要作用靶点之一。3、SKI不同表达可导致胰腺肿瘤对QYHJ治疗反应性的差异,通过对SKI表达情况的检测在一定程度上可用于预测肿瘤对治疗的反应,用于筛选潜在有效的适用人群。
论文目录
相关论文文献
- [1].胰腺癌诊治的研究进展[J]. 医学理论与实践 2019(23)
- [2].胰腺癌流行病学及危险因素[J]. 中国普外基础与临床杂志 2019(12)
- [3].胰腺癌早期诊断的最新关注点[J]. 世界最新医学信息文摘 2019(98)
- [4].美国临床肿瘤协会《潜在可治愈胰腺癌临床实践指南(2019)》更新解读[J]. 中国实用外科杂志 2019(12)
- [5].自噬在胰腺癌及其治疗中作用的研究进展[J]. 外科理论与实践 2019(06)
- [6].胰腺原发性鳞状细胞癌一例[J]. 肝胆胰外科杂志 2019(12)
- [7].十大恶性肿瘤影像分级检查推荐方案(1.0版)之胰腺癌[J]. 中国医学计算机成像杂志 2019(05)
- [8].2019年胰腺癌研究及诊疗新进展[J]. 中国癌症杂志 2020(01)
- [9].胰腺癌临床研究回顾与展望[J]. 中国实用外科杂志 2020(01)
- [10].中药治疗胰腺癌的临床应用及作用机制研究进展[J]. 中国医药导报 2020(07)
- [11].胰腺癌早期诊断的研究进展[J]. 中国微创外科杂志 2020(04)
- [12].从基础到临床：2019年胰腺癌研究进展[J]. 中国癌症杂志 2020(02)
- [13].胰腺癌主要危险因素及其作用机制研究[J]. 医学信息 2020(03)
- [14].自身免疫性胰腺炎胰腺及胰腺外影像学表现[J]. 重庆医学 2020(08)
- [15].胰腺癌的综合治疗进展[J]. 当代医学 2020(11)
- [16].不同影像学方法对胰腺癌的诊断效果比较[J]. 上海医药 2020(10)
- [17].胰腺癌危险因素的研究进展[J]. 基层医学论坛 2020(13)
- [18].胰腺癌相关疾病的研究进展[J]. 中国普外基础与临床杂志 2020(06)
- [19].胰腺癌术后辅助药物治疗的研究进展[J]. 实用肿瘤学杂志 2020(03)
- [20].外泌体在胰腺癌发生发展及诊疗中作用的研究进展[J]. 山东医药 2020(19)
- [21].组织激肽释放酶家族与胰腺癌[J]. 肿瘤防治研究 2020(07)
- [22].可切除/交界可切除胰腺癌综合治疗[J]. 肝胆外科杂志 2020(03)
- [23].微生物与胰腺癌致病机制研究进展[J]. 中国普外基础与临床杂志 2020(08)
- [24].自噬在胰腺癌发生发展及治疗中的研究进展[J]. 海南医学 2020(15)
- [25].大数据推动胰腺癌诊疗水平提高[J]. 中国民间疗法 2020(18)
- [26].日本胰腺学会《胰腺癌临床实践指南（2019年版）》评介[J]. 中国实用外科杂志 2020(10)
- [27].胰腺癌新辅助化疗疗效评估及手术时机[J]. 中华肝脏外科手术学电子杂志 2020(05)
- [28].胰腺癌相关危险因素研究进展[J]. 延边大学医学学报 2020(01)
- [29].胰腺结核19例临床分析[J]. 胃肠病学 2020(04)
- [30].胰岛素样生长因子结合蛋白-2与胰腺癌临床病理因素及诊疗价值分析[J]. 实用癌症杂志 2019(01)