昆虫抗药性相关基因芯片的研制及其应用

论文摘要

随着杀虫剂在农业生产和病媒昆虫防治中的大量应用,越来越多的害虫对杀虫剂产生了抗药性。昆虫对杀虫剂抗性的发展,严重影响了农业生产和虫媒传播疾病的控制,成为害虫综合治理工作中亟待解决的问题。为了揭示害虫的抗药性机理并制定出合理的防治措施,人们对昆虫的抗性形成过程和检测技术进行了广泛的研究,并在分子水平上开展了深入的研究,揭示了昆虫对杀虫剂产生抗性的一些机理。近年来,随着基因芯片技术的发展,已经成功构建了一些昆虫抗性相关基因芯片,并应用于昆虫抗药性研究。这些芯片多是针对蝇类或蚊类昆虫构建,主要集中在昆虫细胞色素P450表达差异的研究,除此之外,尚无其它与昆虫抗性相关的基因芯片的研制报道。本研究选用了6种重要昆虫作为材料,以2761条与昆虫抗性相关的基因序列信息为基础,设计合成了58对专一和简并引物,获得了41类昆虫抗药性相关基因及一种看家基因的DNA片断,构建成含2808个靶标点的昆虫抗药性相关基因芯片,并利用该芯片对家蝇和淡色库蚊的抗性相关基因的差异表达进行了试验性研究,为揭示昆虫对杀虫剂抗性的分子机理,以及检测昆虫对杀虫剂的敏感性变化与抗性形成、发展初步建立了一种灵敏、快速的技术平台。 本研究的结果主要包括以下几个部分: 1 昆虫抗药性相关基因芯片靶标基因的获得 （1）在昆虫抗药性相关基因的选择上,依据不同基因在昆虫对杀虫剂抗性中所起的作用,共选定了41类昆虫抗药性相关基因。这些基因包括28种细胞色素P450基因,4种离子通道基因,2种保护酶基因,4种靶标位点基因,以及3种其它类型的昆虫抗性相关基因。所选基因基本上涵盖了已知的昆虫抗性相关基因类型。此外,选用β-actin基因作为基因芯片上的阳性对照,而阴性对照选用的是pUC-18质粒的部分序列。以2761条昆虫抗性相关基因序列信息为基础,总共设计了58对引物,用于扩增这些靶标基因片段,其中包括39对专一引物以及19对CODEHOP简并引物。 （2）选择了6种重要昆虫作为模板,从中扩增抗药性相关基因片段,以制备昆虫抗药性相关基因芯片。这6种昆虫分别是中华蜜蜂（Apis cerana）,德国小蠊（Blattella germanica）,甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）,家蝇（Musca domestica）,褐飞虱（Nilaparrata lugens）以及淡色库蚊（Culex pipiens）。扩增得到目的片段克隆后,对其进行序列测定以及生物信息学分析,共有646个目的片

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 前言
• 第一部分 文献综述及本研究的内容和技术路线
• 第一章 文献综述
• 第一节 昆虫抗药性概述及其研究技术
• 1 昆虫抗药性概述
• 1.1 昆虫抗药性的概念
• 1.2 昆虫抗药性的历史和现状
• 1.3 昆虫抗药性的危害
• 1.4 昆虫抗药性的形成及演化
• 2 昆虫抗药性的研究及监测技术
• 2.1 生物测定技术
• 2.2 生理研究技术
• 2.3 生化检测技术
• 2.4 分子生物学技术
• 2.5 昆虫抗药性研究和监测技术展望
• 第二节 昆虫对杀虫剂抗性机制的研究进展
• 1 昆虫抗性机制的类型
• 2 昆虫的行为抗性
• 3 昆虫的生理抗性
• 4 昆虫的生理/生化抗性
• 4.1 昆虫的靶标抗性
• 4.2 昆虫的代谢抗性
• 5 昆虫抗药性机制研究展望
• 第三节 基因芯片技术及其在昆虫抗药性研究中的应用
• 1 基因芯片技术研究进展
• 1.1 基因芯片技术概述
• 1.2 基因芯片技术的原理
• 1.3 基因芯片的制备
• 1.4 基因芯片在差异表达研究中的应用及其结果确证
• 2 基因芯片在昆虫抗药性研究中的应用
• 2.1 昆虫抗药性研究用基因芯片的制备
• 2.2 基因芯片在昆虫抗药性研究中的应用及其结果
• 3 基因芯片技术的应用展望
• 第二章 研究内容和技术路线
• 1 研究内容
• 2 本研究的技术路线
• 2.1 总体技术路线
• 2.2 各部分的具体技术路线
• 第二部分 昆虫抗药性相关基因芯片靶标基因的获得
• 第三章 昆虫抗药性相关基因芯片靶标基因的获得
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 靶标基因PCR模板的质量检测
• 2.2 靶标基因的分析
• 3 讨论
• 第三部分 昆虫抗药性相关基因芯片的制备和验证
• 第四章 昆虫抗药性相关基因芯片点样浓度的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同浓度靶基因的杂交荧光信号值
• 2.2 不同荧光标记的探针的杂交信号比
• 3 讨论
• 第五章 昆虫抗药性相关基因芯片的制备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 质粒模板稀释倍数的确定
• 2.2 芯片质量检测结果
• 3 讨论
• 第六章 昆虫抗药性相关基因芯片杂交特异性的验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 杂交芯片扫描结果
• 2.2 靶标点的杂交信号分析
• 2.3 非靶标点的杂交信号分析
• 2.4 基因芯片的杂交特异性分析
• 3 讨论
• 第四部分 昆虫抗药性相关基因芯片在家蝇和淡色库蚊抗药性相关基因表达谱研究中的应用
• 第七章 家蝇抗药性相关基因的差异表达研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性和敏感品系家蝇总 RNA质量检测结果
• 2.2 杂交芯片扫描结果
• 2.3 家蝇抗药性相关基因的差异表达检测
• 2.4 其它昆虫靶基因与家蝇探针的杂交结果分析
• 3 讨论
• 第八章 淡色库蚊抗药性相关基因的差异表达研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性和敏感品系淡色库蚊总 RNA质量检测结果
• 2.2 杂交芯片扫描结果
• 2.3 淡色库蚊抗药性相关基因的差异表达检测
• 2.4 其它昆虫靶基因与淡色库蚊探针的杂交结果分析
• 3 讨论
• 第九章 CYP4D2V2,CYP6A24和CYP6D1V1 基因在不同品系家蝇中表达水平的定量分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 总 RNA质量及浓度
• 2.2 目的片段的克隆
• 2.3 质量 DNA标准品的制备
• 2.4 荧光定量 Pc R结果
• 3 讨论
• 第五部分 总讨论
• 第十章 总讨论
• 1 总讨论
• 2 本研究的主要创新点
• 3 研究展望
• 参考文献
• ABSTRACT