导读:本文包含了磷硫酰化论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:基因组,DNA,异质性特征,上海交大
磷硫酰化论文文献综述
馨娅[1]（2019）在《上海交大团队揭示DNA磷硫酰化基因组修饰异质性特征》一文中研究指出[本刊讯]上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室邓子新院士团队由德林教授研究组与张大兵教授团队杨立桃教授研究组合作,在DNA磷硫酰化修饰研究方面取得新进展:开发了PT-IC-seq和PT-IC-ddPCR两种技术,首次定量地检测了基因组上DNA磷硫酰化修饰位点,揭示了磷硫酰化修饰在全基因组水平上的修饰都存在细胞之间异质性。相关成果于2019年4月1日在线发表于PLoS Genetics。DNA是重要的遗传物质,储存着所有蛋白质和RNA的全部遗传信息。DNA上的任何一个微小的变化都有可能改变(本文来源于《科学》期刊2019年03期）
王俞苹,孔令新,郑涛,李金丽,孙溢华[2]（2019）在《假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰（英文）》一文中研究指出【目的】DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。【方法】首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spf BCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了Spf B蛋白与DNA结合序列。【结果】spf B基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spf B基因的回补能够恢复该表型,证明spf B基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在?spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spf BCDE的启动子区域5′-TGTTTGT-3′相结合。【结论】SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spf BCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。(本文来源于《微生物学报》期刊2019年05期）
吴婷婷[3]（2017）在《磷硫酰化修饰DNA结构特性及抗氧化学功能》一文中研究指出生理性的DNA磷硫酰化修饰(DNA phosphorothioations,PT)是指细菌DNA磷酸骨架上的一个非桥接氧原子被硫原子所取代,具有修饰频率低,立体选择性等特征。本研究主要针对磷硫酰化DNA的抗氧化功能和结构特性进行研究。这种“原位”DNA化学修饰赋予了硫修饰阳性细菌直接清除氧化剂的能力,从而增强了生物抗逆性的生物学功能。但是,在机制方面上仍有若干问题尚未解决:1,磷硫酰化修饰在细菌体内的比例很低(1/1000~1/10000),细菌为什么选择低比例的修饰作为体内抗氧化的“武器”,如果将磷硫酰化修饰的质粒DNA置于体外溶液环境中,对双氧水等氧化剂的抵抗范围有多大?2,该磷硫酰化修饰和传统的含硫还原剂(半胱氨酸,还原型谷胱甘肽)相比,是否具有自身的优点?3,由于磷硫酰化修饰的DNA在双氧水氧化下,会生成氢磷酯,该物质可以使DNA链发生断裂,那么,这种副产物是否会对DNA造成损伤而失去了原有的保护作用。以往磷硫酰化修饰的二核苷位点检测方法主要是HPLC/MS或测序,但二者均破坏了DNA的结构,因此,开发一种开发了磷硫酰化修饰质粒检测的快速检测方法尤为重要。最后,磷硫酰化修饰DNA结构的理论计算很少,且已有研究难以涵盖整个四核苷构象空间,因此,我们通过理论方法对磷硫酰化修饰的构象进行了深入研究。全文内容主要包括四大部分:第一部分内容为磷硫酰化修饰DNA的抗氧化功能研究,首先,以磷硫酰化修饰的大肠杆菌作为研究对象,当细菌在H2O2的作用下,胞内的氧化环境发生改变,细菌启动一系列应答机制来抵抗氧化损伤,PT阳性的细菌对氧化剂的抵御要优于PT阴性细菌;其次,硫代磷酸酯化合物(PS)对羟基自由基有选择性,并且在该反应中,传统的还原剂在浓度较高时会促进氧化反应的发生;再次,氧化剂ABTS·+与H2O2均可以将磷硫酰化修饰二核苷GsA转化为正常二核苷GA,而氢磷酯型GHA只有在高浓度的双氧水中才会产生,通过量子化学计算发现,氢磷酯的形成依赖于H2O2的浓度。因此,由于硫代磷酸酯的特殊化学性质,PT阳性的大肠杆菌具有DNA分子内的抗氧化活性,通过有效清除羟基自由基减少氧化应激,降低细胞内ROS水平,为DNA提供了额外的保护。第二部分内容是通过纳米金介导的增强拉曼光谱对磷硫酰化修饰DNA进行检测。首先,我们通过拉曼光谱检测硫代磷酸酯阴离子、磷硫酰化修饰的二核苷以及质粒DNA,用偏最小二乘-判别分析法(PLS-DA)区分PT修饰位点的碱基组成。结果表明,在水溶液中,PS在603 cm-1和432 cm-1形成两个特征峰;Rp和Sp修饰后的最低能量构型选择不同,Rp构型倾向于形成(g-,anti),Sp构型倾向于形成(anti,g-),但两种构型的拉曼光谱无显着差别。通过偏最小二乘-判别分析,表明质粒DNA在磷硫酰化修饰后的差异谱和GsA-Rp(二核苷)的差异谱最接近,而与其他15种二核苷的差异具有统计学意义,这一点与实验吻合。因此,基于拉曼的方法,可以初步确定磷硫酰化的修饰位点的邻近二核苷序列。第叁部分通过分子模拟的方法对磷硫酰化修饰后的结构特性进行分析,以往研究表明PT修饰的二核苷具有序列偏好性,然而,DNA结构可能受到四核苷酸的侧翼碱基序列的影响,比二核苷酸水平更复杂。因此,我们将256对Rp构象和正常DNA的ε和ζ的均值两两比较后发现,与正常DNA相比,Rp修饰后大多数四核苷中ε的均值减小,ζ的均值增加,导致BII的比例减少,当固定中心的二核苷碱基时,改变四核苷的侧翼序列,ε和ζ会发生明显变化。以往研究表明C8-H8...O3'或C6-H6...O3'形成的氢键数目对于维持BII构型具有重要作用,因此,为了进一步分析BII比例降低的原因,我们根据碱基的不同,对C8-H8...O3'或C6-H6...O3'形成的氢键进行度量,标准为O3’-H距离小于3.5?,结果表明,BII的降低与对应氢键数目的减少呈现正相关,而氢键作为一种弱相互作用,归其根本在于电荷的相互作用,磷硫酰化修饰后,O3'的NBO电子密度为-0.71 e,而正常DNA为-0.89 e,因此,氢键受体的电荷密度降低导致C8-H8...O3'或C6-H6...O3'无法形成,从而稳定BII的因素消失,磷硫酰化DNA大多处于BI状态,很难向BII转化,同时,我们发现在磷硫酰化修饰的对侧Click链的相应位点,BI减少,提示了构象补偿效应。进一步对DNA的大沟和小沟分析后发现,大沟的宽度增加,深度变浅,从而影响了磷硫酰化修饰DNA和蛋白的结合能力。第四部分通过分子模拟的方法对磷硫酰化修饰位点与甲基化酶相互作用方式进行研究,磷硫酰化修饰后,会造成该蛋白局部结构不稳定,Rise和Roll角的增加,碱基平面发生扭转,π-π相互作用减弱,导致甲基化酶和DNA相互作用的局部关键氨基酸和碱基的识别能力改变。其次,对DNA-甲基化酶复合物的结合自由能分析,范德瓦斯能量项中静电作用能量项提供了主要的驱动力,溶剂化自由能非极性部分的能量贡献很小,而溶剂化自由能极性部分的贡献(ΔGPB)贡献较大,且溶剂化能的排序为Rp>N>Sp。Rp修饰后,Arg137发生扭转,难以与碱基平面发生π-π相互作用,从而造成局部结构不稳定,因此,Rp修饰后,甲基化酶与DNA局部的结合方式改变,导致酶的活性降低,甲基化难以发生。本论文通过计算和实验相结合的方法,通过对抗氧化的研究,解释了磷硫酰化修饰抵抗氧化损伤的分子机制;通过拉曼增强光谱分析,开发了一种直接,简便的磷硫酰化修饰位点检测方法;通过分子动力学模拟,第一次提出了磷硫酰化修饰后BI增加的理论模型,并且分析了修饰后甲基化酶活性降低的机制,对后续的实验和理论研究具有指导意义。(本文来源于《上海交通大学》期刊2017-12-01）
陈超[4]（2017）在《DNA磷硫酰化修饰的基因组定位及其与DNA甲基化限制—修饰系统间的相互影响》一文中研究指出早在1952年,Alfred Hershey与Martha Chase合作利用噬菌体侵染细菌的实验,证实了生命的遗传物质是DNA而非蛋白质,与前人的肺炎双球菌转化实验一起,推翻了二十世纪早期生物学家所相信的蛋白质是遗传物质这一观点。这一发现是利用35S特异性标记的噬菌体蛋白质与32P特异性标记的噬菌体DNA,因为当时的观点认为,硫元素是蛋白质的特征元素,而核酸DNA中仅含有碳、氢、氧、氮和磷这5种元素。而近年来,科研人员在细菌的DNA的骨架上寻觅到了硫元素的踪迹,并把这种特殊的DNA修饰结构称之为DNA磷硫酰化修饰(phosphorothioation,PT)。进一步研究表明,这种新型修饰由5个修饰蛋白(DndABCDE)共同催化,将来自于半胱氨酸的硫原子序列特异性地取代DNA磷酸骨架上的非桥连氧原子。DNA磷硫酰化修饰修饰常常与DndFGH蛋白共同组成限制-修饰系统,以此来抵御外源DNA的入侵,保持自身遗传物质稳定。前期研究中,利用液相色谱-质谱联用技术,科研人员已经对来自于不同菌属的DNA中的磷硫酰化修饰情况,在d(XPSY)(X=A、T、C或者G,Y=A、T、C或者G)这一的二核苷酸水平上,进行了定性分析和定量检测,发现其修饰序列与修饰频率在不同细菌中的具有不同的修饰特征,但是,由于技术手段的限制,DNA磷硫酰化修饰所需的更长的保守基序,一直以来是一个研究难点,针对DNA磷硫酰化修饰的细菌基因组定位也一直是一个谜,而这一科学问题的回答,则可能是揭示DNA磷硫酰化修饰这一新型修饰的生理功能的突破口。本研究以Vibrio cyclitrophicusFF75为研究对象,通过第叁代测序技术——单分子实时(single molecularrealtime,SMRT)测序技术,找到了在FF75中,DNA磷硫酰化修饰的核心基序列为5'-CPSCA-3',我们没有找到更长的保守序列或者侧翼序列,但是其下游序列具有一定的偏好性,DNA磷硫酰化修饰倾向于发生在5'-CCAA-3'或者5'-CCAG-3'这样的序列上,而发生在5'-CCAT-3'上的概率最低;在FF75基因组上,仅有14%的5'-CCA-3'序列发生了磷硫酰化修饰,且其在FF75中呈现出一种单链修饰状态;在此基础上,我们绘制基于基因组水平的DNA磷硫酰化修饰图谱,对FF75中的DNA磷硫酰化修饰进行了基因组的精细定位,发现了其在基因组上随机、均匀的分布特征,且在不同细菌个体中,表现出异质性的特定,揭示了其部分、动态的修饰特征。此外,在本项工作中,我们还发现DNA磷硫酰化限制-修饰系统的功能能够与DNA甲基化依赖的限制-修饰系统产生相互影响。一方面,发生于DNA骨架的磷硫酰化修饰与发生在DNA碱基上的甲基化修饰可以共享同一段DNA序列,得到同时具有两种修饰的杂合结构d(GPS6mA),且其构型与细菌体内的DNA磷硫酰化修饰一样具有RP的构型;同时,在体外条件下,具有磷硫酰化修饰结构的DNA序列能够降低Dam甲基转移酶的甲基化效率;另一方面,本研究还发现DNA磷硫酰化限制系统是一种温度依赖的限制系统,其在低温条件下,dndFGH的转录水平会有所上升,而有意思的是这种低温依赖的磷硫酰化限制作用能够被甲基化的DNA阻碍,即DNA甲基化修饰能代替DNA磷硫酰化修饰,保护DNA免受DndFGH的限制作用。(本文来源于《武汉大学》期刊2017-10-01）
陈实[5]（2017）在《细菌DNA磷硫酰化表观遗传修饰系统》一文中研究指出DNA磷硫酰化修饰,是由dndAB CDE组成的基因簇负责完成的,存在于细菌DNA骨架上的生理修饰。该修饰能够用硫原子取代DNA磷酸二酯键上的非桥连氧原子。DNA的磷硫酰化修饰在不同菌属间存在序列的特异性,且具有Rp空间构象的专一性。DNA磷硫酰化修饰是目前发现唯一存在于DNA骨架上的特异性生理性修饰,由DndB CDE-DndFGH组成的依赖于DNA磷硫酰化修饰的"限制-修饰"系统,在(本文来源于《第十届全国化学生物学学术会议报告摘要集（青年科学家论坛）》期刊2017-09-23）
郑涛[6]（2017）在《DNA磷硫酰化修饰蛋白DndEi的功能和磷硫酰化修饰频率的研究》一文中研究指出DNA磷硫酰化(PT)修饰是DNA骨架磷原子上非桥接的氧原子取代为硫的修饰,这是首次发现的位于DNA骨架上的生理修饰,也是首次在DNA中发现硫元素。细菌中的DNA磷硫酰化生理修饰由DndA-E组成的蛋白复合体负责完成,各个蛋白的功能已经得到了研究,但是修饰过程的生化机制依然不清楚。此外,高通量测序技术揭示了磷硫酰化修饰在基因组DNA上的分布规律,但是基因组上各个位点的修饰频率还不清楚。为此,本论文对DNA磷硫酰化修饰的生化机制和修饰频率进行了研究。首先,通过对鸭疫里默氏杆菌修饰蛋白DndEi的功能研究,揭示了DNA磷硫酰化修饰需要DNA解旋酶和ATP酶参与的生化机制。DndEi是一种新型的磷硫酰化修饰蛋白,相对于传统的DndE蛋白,它多了一个结构域。体外生化实验表明该结构域具有DNA解旋酶活性,体内缺失该结构域会导致磷硫酰化修饰活性的丧失,表明解旋酶活性是DNA磷硫酰化修饰必需的。DndEi还具有ATP酶活性,并且它的ATP酶活性能够被含有GAAC/GTTC序列的DNA促进,暗示着DNA磷硫酰化修饰是一个需要ATP水解提供能量的酶促反应。其次,对大肠杆菌基因组DNA磷硫酰化修饰的频率进行了定量研究。开发了一种定量检测DNA磷硫酰化修饰频率的方法:用碘对样品进行处理,磷硫酰化修饰的DNA会在修饰位点处发生双链断裂从而实现和未修饰DNA的区分;利用微滴式数字PCR对两种DNA分子绝对定量,然后计算得到磷硫酰化修饰频率。利用该方法对大肠杆菌B7A基因组上8个位点的修饰频率检测,发现这些位点的修饰频率都在50%以下且有些位点未被修饰,说明DNA磷硫酰化修饰是一种不完全修饰。此外,对大肠杆菌B7A不同克隆以及同一个克隆不同生长时期的修饰频率检测,发现磷硫酰化修饰存在动态变化的特征。本论文发现磷硫酰化修饰需要DNA解旋酶和ATP酶的参与,加深了对修饰的生化机制的理解;开发了一种定量检测磷硫酰化修饰频率的方法,实现了基因组DNA磷硫酰化修饰频率的精确定量,揭示了磷硫酰化修饰是不完全修饰和动态修饰的特性,为阐明DNA磷硫酰化修饰的生物化学机理和生物学功能奠定了基础。(本文来源于《上海交通大学》期刊2017-02-01）
张姗姗,全日城,杨晓红,许勇钢,胡晓梅[7]（2015）在《青黄散治疗骨髓增生异常综合征DNA磷硫酰化探析》一文中研究指出目的:研究硫化砷制剂青黄散对骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndromes,MDS)患者DNA双链结构的影响,硫元素是否可加入DNA骨架,是否有DNA结构的硫酰化修饰。方法:以持续服用青黄散6个月以上并有血液学改善的MDS患者骨髓DNA样本10例,以琼脂糖包埋,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测骨髓细胞DNA降解表型。利用BIO-RAD CHEF-DRⅢSystem脉冲电泳进行分析。结果:经过硫修饰后DNA构象发生变化,这种硫修饰结构对电泳过程阳极积累的Tris过酸衍生物敏感而遭到位点特异性攻击,引发DNA的双链切割反应出现DNA降解现象。电泳后标本DNA结构完好,在Tris缓冲液下未出现DNA降解现象。结论:青黄散治疗有效的患者骨髓细胞DNA骨架中没有磷硫酰化修饰现象,说明青黄散疗效机制不通过硫修饰系统。(本文来源于《中国中医基础医学杂志》期刊2015年10期）
曹博[8]（2014）在《DNA磷硫酰化修饰的基因组分布及其生理生化研究》一文中研究指出DNA磷硫酰化修饰是目前唯一被发现的DNA骨架上的天然修饰,即硫原子取代DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子形成磷硫酰化修饰。它突破了DNA由碳、氢、氧、氮、磷五种元素构成的结论,拓展了经典的DNA组成理论,引起了国内外广泛关注。尽管对这种新型表观遗传学修饰的相关基因组成、化学结构鉴定、修饰序列特异性以及限制外源基因自我保护等研究方面取得了一定的进展,但仍然有以下一些科学问题尚未解析:(1)质谱技术检测发现磷硫酰化修饰以不同修饰频率广泛存在于原核生物基因组上不同的二核苷酸之间。然而,修饰所需的保守序列及在基因组上的分布情况仍然是该领域尚未解析的重要科学问题。(2)磷硫酰化修饰是由5个基因组成的基因簇(dnd A-E基因簇家族)负责的,但是修饰发生的酶学机理尚未阐明。(3)生理功能方面,磷硫酰化修饰被证实参与了一种新型限制修饰系统,该系统限制不含磷硫酰化修饰的质粒DNA转化进入其宿主菌,而这一限制系统的作用机理及其酶学特性尚未得到研究。为了进一步理解DNA磷硫酰化修饰这一新型表观修饰现象,解析以上科学问题,本论文致力于以下叁个方面的研究:一、DNA磷硫酰化修饰基因组分布图谱的解析。本研究建立了两种基于不同原理的方法,用于鉴定基因组上的磷硫酰化修饰位点:单分子实时DNA测序技术(Single-Molecule Real-Time DNA sequencing,简称SMRT)和碘切割依赖的DNA深度测序技术(Iodine-cleavage based deep DNA sequencing,简称ICDS)。利用这两种技术,以大肠杆菌(Escherichia coli B7A)为模式菌株,获得了首个细菌DNA磷硫酰化组图谱。其中,SMRT技术可以实现在DNA测序过程中对修饰位点进行直接检测,发现在B7A约5.2 Mb基因组上,共含有4855个磷硫酰化修饰位点,这些修饰位点共有的保守序列为4 bp的GpsAAC/GpsTTC motif。然而,基因组上只有约12%(4855/40,701)的GAAC/GTTC位点发生了修饰。SMRT单分子分析发现,磷硫酰化修饰具有部分修饰(partial modification)的特征,即这些修饰位点在不同的DNA分子上并非一直被修饰,而且不同修饰位点具有不同的修饰频率。ICDS技术则是基于磷硫酰化修饰位点可以被碘特异性切割的化学特性,实现了对修饰位点的间接定位。ICDS技术鉴定了B7A基因组上7000多个磷硫酰化修饰位点,这些位点90%以上与SMRT技术检测到的位点相一致,而且该技术较SMRT技术检测到了更多处于低修饰频率的位点。对B7A基因组磷硫酰化修饰图谱进行分析,发现除了核心保守序列以外,修饰对侧翼序列以及基因组功能区域均具有一定的偏好性,这对进一步研究其生理学功能和酶学催化机理提供了指导和理论依据。二、磷硫酰化修饰依赖的限制系统的作用机制。首次发现该限制系统具有与经典的甲基化依赖的限制系统具有多方面不同的作用特征:在磷硫酰化修饰缺失的情况下,限制系统的存在对修饰突变株宿主不具有致死效应,而是造成了宿主明显的病理表型,如生长迟缓,细胞膜损伤,细胞分裂障碍等。基因组转录谱分析发现,限制系统的单独存在影响了修饰缺失宿主多达600余个基因的表达,而且这些基因的功能与宿主菌表型的改变相吻合。通过TUNEL实验,获得了限制系统对修饰缺失宿主的基因组DNA造成断裂损伤的直接实验证据。限制酶体外分析具有ATP水解酶活性,说明该限制系统是ATP依赖的、对不含磷硫酰化修饰的DNA通过某种方式造成断裂损伤的作用机理。叁、DNA磷硫酰化修饰蛋白的酶学特征及作用机理。细菌基因组上磷硫酰化修饰具有部分修饰现象,说明修饰酶具有特殊的底物选择性。通过建立一种细胞裂解液体外催化DNA磷硫酰化修饰的反应系统,发现体外DNA磷硫酰化修饰具有比细胞内更广泛的底物选择性,即胞内未被修饰位点可以在细胞裂解液中发生修饰,而且修饰位点的侧翼序列对修饰发生没有影响。此外,一条链修饰的DNA可以被催化成为双链修饰,而对单链DNA则不具有催化活性。体外酶学实验证实,沙门氏菌的磷硫酰化修饰蛋白Dpt CDE以蛋白复合体的形式行使功能,且蛋白复合体中的3个蛋白亚基都是以四聚体的形式存在。该蛋白复合体具有非序列特异性的DNA结合活性。DNA磷硫酰化修饰是表观遗传学领域近年发现的一种新型生理修饰,本论文的相关工作推动了这种新型表观遗传学修饰研究的向前发展:(1)细菌基因组DNA磷硫酰化修饰分布图谱的解析,加深了对DNA磷硫酰化修饰这一新兴研究领域的理解,为进一步研究其生理功能提供了理论参考和指导,对理解这一特殊表观遗传学修饰的生物化学过程也提供了重要依据。(2)DNA磷硫酰化修饰依赖的限制系统的作用机制研究的系列发现,揭示了它是完全不同于传统限制修饰系统的一种新型限制修饰系统,加深了人们对自然界中基因组防御系统多样性的认识。(3)DNA磷硫酰化修饰酶催化体系的构建以及催化复合体相关酶学研究,加深了人们对这一特殊生物催化途径的理解,为利用酶催化方法制备序列特异性和构型专一性的磷硫酰化修饰DNA奠定了基础。(本文来源于《上海交通大学》期刊2014-11-01）
赖崇德[9]（2014）在《DNA磷硫酰化修饰体系中dndE基因的功能分析及相关蛋白纯化体系的建立》一文中研究指出在早期的研究中,科研人员在对变铅青链霉菌DNA电泳过程中发现了一种奇特的DNA降解(DNA degradation)现象,简称Dnd现象。经深入研究发现该降解发生的原因是由于细菌染色体上发生了新型DNA表观遗传修饰,即通过一段与降解表型相关的基因簇(命名为dnd基因簇)将DNA骨架上非桥联的氧原子替换为硫原子,造成细菌DNA在Tris缓冲液电泳过程中被阳极产生的Tris氧化衍生物切割,从而导致DNA的降解。该研究的发现,揭示了DNA中第六种物质硫元素的存在,后续研究也证实该类型修饰仅广泛存在于原核生物中,且是一种具有Rp空间结构专一性、修饰位点特异性的DNA表观遗传修饰现象。通过同源性比对预测功能,蛋白纯化测定酶活力,以及蛋白质结晶分析其空间结构、功能及活性位点等技术,研究人员对dnd基因簇中每个基因的功能都展开了一定的研究。科研人员在对DndE进行结晶后发现,在DndE的表面存在K17、K18、K20、K53、K87、K91六个关键的赖氨酸活性位点。体外实验也发现这些赖氨酸的突变,会导致DndE与双链DNA,尤其是缺刻双链DNA的亲和能力的显着下降。本课题利用LC-MS/MS串联质谱技术、定点突变等方法,研究来源于沙门氏菌S. enterica serovar Cerro87中DndE蛋白在体内生理条件下,所发挥的生物学功能及活性。本研究是以质粒pJTU1238为基础通过一系列的基因工程改造完成的。质粒pJTU1238是一个含有沙门氏菌S. enterica serovar Cerro87完整dnd修饰基因簇dndBCDE四个基因的质粒,能够通过异源表达,为外源宿主DNA引入磷硫酰化修饰。而dndE的缺失,会阻断pJTU1238对宿主的磷硫酰化修饰途径,证明dndE在这生理途径中的必须性,同时也证明在宿主细胞中,没有与DndE功能相似或可取代其功能的蛋白,从而为本研究工作的开展提供了清晰的遗传背景。本研究针对质粒pJTU1238上的dndE基因进行定点突变和同框缺失,获得了一系列的pJTU1238衍生质粒,并将其分别同源回补入沙门氏菌硫修饰缺失突变株XTG102中。同时通过异源表达,将pJTU1238及其衍生质粒导入一系列的E. coli模式菌株DH10B、DH5α、ER2796以及Mach Ⅰ中,研究dndE基因突变后对DNA磷硫酰化修饰的修饰频率及修饰位点的影响。本研究结果证实,在DndE蛋白上,K18与K20这两个赖氨酸位点,是DndE蛋白中发挥作用的关键性位点。但同时也证明,即使是这两个位点都进行了突变,仍然不会影响磷硫酰化修饰的发生,而只是降低修饰频率。这说明了DndE蛋白在体内生理条件下,并不只是发挥结合带缺口双链DNA的功能,而是在整个磷硫酰化修饰的生理途径中可能还具有其他方面尚未揭示的功能。当然,在整个E. coli系统中,是否也有其他的蛋白也在协助完成这一修饰系统,也是后续需要研究的。同时,本研究也通过qRT-PCR技术与Western blot技术,研究在XTG102和E.coli DH10B中,pJTU1238及其衍生质粒转入宿主后,dndE上关键位点的突变导致dndE基因在转录以及翻译水平上的变化。并分析在相同的转录水平下对磷硫酰化修饰的修饰频率的影响,以及分析在相同翻译条件下,对磷硫酰化修饰状况的差异。经研究发现,DndE上6个不同赖氨酸位点的突变,会导致在相同菌中修饰频率的差异性很大。而且在不同的菌中,DndE上相同的氨基酸突变位点也会造成很大的影响。目前,对沙门氏菌S. enterica serovar Cerro87中磷硫酰化修饰基因簇中单个蛋白的异源表达和纯化仅有少量报道。本工作将沙门氏菌S. enterica serovar Cerro87中的dnd基因簇中dndA、dndC、dndD、dndE进行体外质粒构建与异源表达与纯化。希望以此为契机,深入了解每个蛋白所发挥的功能及生物学效应,并帮助了解磷硫酰化修饰的生化途径。(本文来源于《武汉大学》期刊2014-10-01）
本刊编辑部[10]（2014）在《破译DNA磷硫酰化修饰基因组分布图谱》一文中研究指出DNA是生命的遗传物质,由碳、氢、氧、氮和磷五种元素组成的四种脱氧核苷酸所构成的DNA序列,储存着生物界无穷无尽的遗传信息。对DNA结构和功能的每一次全新认知,都是生命科学发展里程碑式的成果。DNA甲基化作为一种表观(本文来源于《实验室研究与探索》期刊2014年09期）
磷硫酰化论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
【目的】DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。【方法】首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spf BCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了Spf B蛋白与DNA结合序列。【结果】spf B基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spf B基因的回补能够恢复该表型,证明spf B基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在?spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spf BCDE的启动子区域5′-TGTTTGT-3′相结合。【结论】SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spf BCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
磷硫酰化论文参考文献
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