急性冠脉综合征对高密度脂蛋白亚组分功能及蛋白质组学的影响

论文摘要

研究背景流行病学研究和动物实验表明,血浆高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平与冠心病（CAD）风险呈高度负相关关系,HDL-C每下降1mg/dl心血管疾病风险可升高2%-3%。HDL是一个复杂的多功能蛋白复合体,可通过其促进胆固醇逆转运（Reverse Cholesterol Transport, RCT）)、抗炎、抗氧化及抗血栓形成等多种功能发挥抗动脉粥样硬化（AS）作用,其中,促胆固醇逆转运（RCT）功能最为关键。然而,现已有大量研究证实HDL-C水平高低并不能准确代表HDL的整体功能,HDL-C水平检测作为HDL功能的度量标准以及预测冠心病发病风险的生物指标存在明显的局限性：研究发现,用CETP抑制剂torcetrapib治疗冠心病患者,虽然使HDL-C水平升高了72%,但冠心病事件的发生率却随之升高；与之相反的是,载脂蛋白AI（Apo-AI）自然变异为Apo-AIMilano的人群,虽然血浆HDL-C水平低,但冠心病事件的发生率也低。可见,对HDL质（HDL功能）的关汁较HDL量（HDL-C水平）的关注更为重要。2011年Amit V.Khera等在新英格兰杂志上发表了一篇文章：他们通过检测203例正常人群（已进行颈动脉内膜中层厚度（IMT）评估）、442例患者（冠状动脉血管造影证实有冠心病者）及351例病例对照患者（冠状动脉血管造影证实无冠心病但不排除有其他基础疾病者）的巨噬细胞胆固醇转出率,并以心血管疾病危险因子、HDL-C及载脂蛋白A-I水平作为协变量对胆固醇转出率与IMT进行线性回归分析发现：HDL-C与IMT之间不存在显著的相关关系；巨噬细胞胆固醇转出率与IMT和CAD风险高度负相关,此相关关系独立于HDL-C水平；HDL介导的巨噬细胞胆固醇转出率功能与AS的发生发展独立相关。这些发现提示HDL功能评估较HDL-C水平更有助于我们理解HDL的抗AS作用,预测AS及冠心病的发病风险。此外,关于HDL颗粒组成及生物特性存在异质性的一些报道的出现进一步强化了对HDL功能进行评估的需要。最新的基础和临床研究发现,在急性期反应、慢性炎症以及一些代谢性疾病中,高密度脂蛋白（HDL）的抗动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）减弱,甚至出现致AS作用,其机制可能与各种疾病状态下HDL结构及组成成分的改变导致HDL失功能有关。Shao等研究证实,氧化损伤可损害HDL主要组成蛋白载脂蛋白A-I （apolipoprotein A-I, apoA-I）促胆固醇逆转运功能,其机制可能与HDL发生氧化修饰有关。Heinecke发现,从冠心病患者血浆分离出的HDL中髓过氧化物酶的两种产物（氯酪氨酸和硝基酪氨酸）均明显升高,推测冠心病患者HDL抗氧化功能可能受到了损害。急性冠脉综合征（acute coronary syndromes,ACS）发生时,患者机体处于一种特殊炎症及氧化应激环境中,如急性心肌梗死患者体内促炎因子趋化因子配体-16（Cxc Chemokine Ligand, CXCL16）较慢性动脉粥样硬化患者明显升高,这种微环境的改变可能导致HDL中蛋白及磷脂组成成分的改变,进而使HDL功能发生改变。动物研究证实即使在血浆HDL-C水平升高情况下,与HDL代谢相关蛋白的改变仍可促进AS的发生。几个小规模研究发现,在炎性条件下HDL抗炎功能减弱。因而,我们推测ACS可能通过其独有的炎症反应改变HDL的组成成分进而使HDL发生失功能转变。蛋白质的结构决定其功能。蛋白质组学技术的应用为HDL功能学的研究提供了新的方法和思路。最近的一些研究显示HDL蛋白质组学与HDL功能密切相关,已发现组成HDL的蛋白主要涉及以下四方面作用：脂质代谢、补体激活、急性期反应、蛋白质水解调节,提示HDL蛋白质组学的改变可能在HDL功能变化中扮演着至关重要的作用。应用密度梯度超速离心技术,可将HDL颗粒按其密度大小分为HDL1、HDL2和HDL3三种亚类,血浆中以HDL2和HDL3为主（各占1/3和2/3）。HDL3为小的、密度较大、未成熟的颗粒,HDL2为大的、密度较小、成熟的颗粒。多数流行病学研究显示成熟的HDL2的动脉保护作用强于HDL3（Miller NE. Am Heart J,1987 113,589-597）,但亦有报道认为二者具有同等强弱的动脉保护作用。近来对关于HDL亚组分的蛋白组学研究,主要集中在HDL3中特殊蛋白的水平,尤其是apoL-1、PON1、PON3与HDL3阻止LDL氧化的能力有关,实验表明HDL亚组分蛋白质组成是决定HDL功能的基础[22]。目前,国内外对于不同人群中HDL亚组分（HDL2,HDL3）不同蛋白组成与HDL功能（逆胆固醇转运,抗炎,抗氧化）的关系尚无报道；ACS的发生是否可导致HDL亚组分蛋白质组学的改变进而改变HDL亚组分功能国内外亦未见报道。目的通过评估健康人群及急性冠脉综合征（ACS）患者高密度脂蛋白（HDL）亚组分（HDL2和HDL3）的促胆固醇逆转运、抗炎、抗氧化功能,明确ACS是否可损害HDL亚组分的功能使其发生失功能改变。同时利用蛋白质组学相关技术分析健康人群与ACS患者HDL亚组分的蛋白质组学差异,探讨ACS导致HDL亚组分失功能改变的可能蛋白质组学机制。方法纳入2011年1月-2012年1月在南方医院心内科住院的ACS患者（ACS组）及同期在我院体检的健康体检者（对照组）各40例。分别检测两组血脂四项、超敏C反应蛋白（hsCRP）、HDL亚组分（HDL2和HDL3）介导的J774巨噬细胞[3H]胆固醇转出率、HDL亚组分屏氧酶-1（PON1）活性、脂氢过氧化物（LOOH）水平及炎症指数（HII）。血浆HDL亚组分的分离采用超高速密度梯度离心法,HDL亚组分组成蛋白的分离采用双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术,差异蛋白的鉴定采用质谱分析。1、测定ACS患者及对照人群的基本指标（1）采用酶法在全自动生化仪上测定血脂四项（TC、TG、HDL-C、LDL-C）;（2）采用透射比浊法测定血清hs-CRP；2、测定ACS患者及对照人群的HDL2及HDL3功能指标（1）抽取空腹血并抗凝,采用超速离心法分离并提取HDL2及HDL3；（2）利用乙酸苯酯法检测HDL2及HDL3颗粒上抗氧化酶PON1活性；（3）利用液闪计数仪检测HDL2及HDL3介导的巨噬细胞[3H]]胆固醇转出率；（4）非细胞学法测定HDL2及HDL3的炎症指数（inflammatory index）;（5）采用改进的二甲苯酚橙显色实验法测定HDL2及HDL3颗粒中LOOH的水平。3、分析ACS患者及对照人群的HDL2及HDL3蛋白质组学差异（1）采用双向荧光差异凝胶电泳技术（2D-DIGE）寻找不同HDL2或HDL3样本的差异蛋白点；（2）采用质谱分析法技术获得蛋白样品的肽质量指纹图谱和肽序列标签后,通过查询Swissprot蛋白数据库获得蛋白质的相关信息,选择可能具有重要意义的差异蛋白；（3）采用western-blot、酶联免疫吸附法（ELISA）技术验证不同HDL2或HDL3样本中某些有重要意义的差异蛋白。结果1、ACS组与对照组基本临床资料比较：与对照组比较,ACS组血清LDL-C水平及hs-CRP浓度均明显升高（t=2.972,P=0.004或t=9.175,P<0.001）,差异具有统计学意义；而两组年龄、TC、TG及HDL-C水平比较,无明显差异,差异均无统计学意义（P>0.05）。2、ACS对HDL亚组分功能的影响：ACS组患者VS对照组：HDL2-PON 1活性为（77.58±14.88）U/mg VS （110.00±14.95）U/mg；HDL3-PON 1活性为（75.83±14.97）U/mg VS（104.57±13.16） U/mg；HDL2-胆固醇转出率为（20.6±3.7）%VS（27.7±5.5）%；HDL3-胆固醇转出率：（18.4±3.8）%VS（24.7±6.2%）%；HDL2-炎症指数为（1.25±0.27）VS（0.48±0.12）； HDL3-炎症指数为（1.32±0.27）VS（0.62±0.15）；HDL2-LOOH水平为（18.46±4.70）ngLOOH/（ug.chole）VS（9.09±2.27）ngLOOH/（ug.chole）；HDL3-LOOH水平为（21.30±5.64）ngLOOH/（ug.chole）VS（11.4±2.81）ngLOOH/（ug.chole）。统计学结果表明,与对照组比较,ACS组HDL亚组分PON1活性及其介导的巨噬细胞[3H]胆固醇转出率均明显下降（P<0.001）,炎症指数及LOOH水平则均较对照组明显升高（P<0.001）。3、同一组内HDL2和HDL3功能比较:同组内HDL2和HDL3介导的胆固醇转出率比较,无论是在对照组或是ACS组,HDL3介导的胆固醇转出率均低于HDL2[正常组HDL2 VS HDL3:（27.7±5.5）% VS（24.7±6.2）%,P=0.027；ACS组HDL2 VS HDL3:（20.6±3.7）%VS（18.4±3.8）%, P=0.012]；而HDL3-LOOH水平则高于HDL2[正常组HDL2 VS HDL3:（9.09±2.27） ngLOOH/（ug.chole）VS（11.44±2.81）ngLOOH/（ug.chole）,P<0.001；ACS组：（18.46±4.7）ngLOOH/（ug.chole）VS（21.3±5.64）ngLOOH,（ug.chole）,P=0.017]。4、ACS对高密度脂蛋白亚组分蛋白质组学的影响：利用蛋白质组学技术比较ACS组与对照组HDL亚组分蛋白质组学差异,我们发现了48个差异蛋白点。通过质谱分析,本研究证实：与对照组比较,ACS患者HDL3中有9个蛋白表达上调,包括载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白E、载脂蛋白L1、屏氧酶、a-1B-糖蛋白、血清淀粉样蛋白P物质、维生素D结合蛋白、纤维蛋白原Y链；而ras-related protein Rab-7b蛋白则表达下调；同时与对照组比较,HDL2中有12个蛋白表达下调,包括载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白E、载脂蛋白L1、屏氧酶、触珠蛋白、血色素结合蛋白、转铁蛋白、补体因子B、ras-related protein Rab-7b、纤维蛋白原γ链、免疫球蛋白γ-1链C区域；4个蛋白表达上调,包括血清淀粉样蛋白P物质、a-1-抗胰蛋白酶、酸性酰胺酶、维生素D结合蛋白。此外,我们还利用酶联免疫吸附法（ELISA）测定了两组人群血清中血清淀粉样P物质（SAP）的浓度,发现ACS患者血清中SAP浓度较对照组明显升高[（3.53±0.41）lg （ng/ml） VS （3.11±0.48） （1g ng/ml）,P< 0.001],差异具有统计学意义。结论1、ACS可损害HDL亚组分的功能,使具有抗动脉粥样硬化作用的功能性HDL亚组分转变为具有促动脉粥样硬化作用的失功能HDL亚组分。2、成熟的HDL2较未成熟的HDL3具有更强的促胆固醇逆转运及抗氧化功能,提示HDL2可能较HDL3具有更强的心血管保护作用。3、ACS可改变HDL亚组分的蛋白组成,重塑HDL亚组分蛋白质组学,而这种蛋白质组学的改变可能是ACS导致失功能HDL亚组分发生的一重要机制。此外,我们还发现2个新的存在于HDL2及HDL3中的蛋白：SAP及Rab7b。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 实验流程图
• 第一部分 急性冠脉综合征对高密度脂蛋白亚组分功能的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 急性冠脉综合征对HDL亚组分蛋白质组学的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 创新、展望与不足
• 参考文献
• 中英文缩略词表
• 综述
• 参考文献
• SCI投稿
• 论文发表情况
• 致谢