罗非鱼肌动蛋白基因启动子与生长激素基因的克隆及在真核细胞中的活性表达

论文摘要

罗非鱼是世界性主要养殖鱼类,养殖范围已遍布105个国家和地区,是联合国粮农组织（FAO）向全世界推广养殖的优良品种。由于它具有味美、无脊间刺、易加工的优点,在许多国家正被作为海洋捕捞鱼类的替代品。随着世界海洋渔业资源量的减少,罗非鱼在国际水产品贸易中的地位越来越重要,交易量（额）逐年上升。通过转基因技术可以培育出生长快速、抗逆罗非鱼,为此我们通过分子生物学手段获得了两个构成转基因表达载体的重要元件：肌动蛋白基因启动子和生长激素基因。所以本研究内容包括两部分：以尼罗罗非鱼基因组DNA为模板,使用高保真PCR方法分离得到1675bp的β-actin基因启动子,且已知的典型调控序列并未发生变化。通过序列测定并与其他鱼类及人类β-actin基因启动子相比较,发现尼罗罗非鱼β-actin基因启动子调控区具有典型的启动子特征,含有TATA Box、CArG和CCAAT Box 3个重要的顺势作用元件。同时成功构建了CMV启动子缺失的含有p-actin基因启动子及EGFP基因的重组表达载体pEGFP-β-actin,并通过脂质体转染将重组表达载体pEGFP-β-actin转到NIH293T细胞中。荧光显微镜观察到NIH293T细胞中发出绿色荧光,结果表明尼罗罗非鱼β-actin基因启动子能够驱动EGFP的表达,证实在真核细胞水平尼罗罗非鱼β-actin基因启动子具有较好的表达活性。从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）脑垂体中分离其总RNA,经反转录合成为第一条cDNA链,再以第一条cDNA为模板,经过RT-PCR,克隆得到全长785bp的生长激素基因,序列分析表明：GH开放阅读框为615bp,共编码204个氨基酸；其中含有17个氨基酸的信号肽和187个氨基酸的成熟GH序列。同时我们将其插入到载体启动子下游,与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）报告基因融合,重组质粒经菌液PCR、限制性内切酶酶切和测序进行鉴定。通过脂质体转染分别将pEGFP-GH重组表达载体、pEGFP-N1转到293T细胞中,以检测尼罗罗非鱼GH基因表达的活性。结果显示,阳性对照组pEGFP-N1,有荧光表达的细胞占90%以上;pEGFP-GH可见绿色荧光,但是有荧光表达的细胞较少,强度较弱。上述实验现象表明,所获得的尼罗罗非鱼GH基因具有较好的表达活性,能够在真核细胞中表达。本研究成功获得了尼罗罗非鱼β-actin基因启动子和GH基因,同时通过细胞转染首次在真核细胞中有力的证实了其具有一定的生物活性；为进一步验证尼罗罗非鱼β-actin基因启动子和GH基因的生物活性,本试验还尝试将其转染到不同的真核细胞中,如Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）,仍然能够观察到有荧光发出,但强度要比在293T细胞中弱,这可能与细胞的特性有关。总之,本试验成功获得了有生物活性的尼罗罗非鱼β-actin基因启动子和GH基因,为将来进行转基因尼罗罗非鱼研究提供了两个重要的元件。此外,本人还对太湖鲢鱼mtDNAD-loop区遗传多样性进行了研究,结果表明,太湖鲢鱼的mtDNAD-loop个体序列变异程度较大,遗传多样性较为丰富。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1. 启动子克隆方法的研究进展
• 1.1 启动子及其结构模型
• 1.2 启动子克隆的几种方法
• 1.2.1 利用启动子探针质粒载体筛选启动子
• 1.2.2 利用PCR技术克隆启动子
• 1.3 启动子克隆的意义
• 2. 鱼类生长激素基因的研究进展
• 2.1 鱼类生长激素的结构特征和功能
• 2.2 鱼类生长激素的分离及活性检测
• 2.3 我国鱼类生长激素基因的研究现状
• 2.3.1 鱼类生长激素基因克隆
• 2.3.2 鱼类转生长激素基因
• 2.4 鱼类生长激素基因研究展望
• 第二章 β-actin基因启动子与GH基因克隆与活性研究
• 1. 前言
• 2. 实验材料
• 3. 实验步骤
• 3.1 尼罗罗非鱼采血方法
• 3.2 罗非鱼脑垂体总RNA的提取及检测
• 3.3 基因组DNA的提取及检测
• 3.4 RT-PCR扩增
• 3.5 PCR扩增
• 3.6 DNA的纯化和回收
• 3.7 克隆
• 3.8 质粒DNA的提取
• 3.9 阳性克隆的鉴定
• 4. 细胞转染
• 4.1 材料与试剂
• 4.2 pEGFP-β-actin启动子表达质粒构建
• 4.3 pEGFP-GH融合蛋白表达质粒构建
• 4.4 细胞转染
• 4.5 EGFP与293细胞
• 5. 实验结果
• 5.1 尼罗罗非鱼β-actin基因启动子功能验证结果
• 5.1.1 尼罗罗非鱼β-actin启动子序列
• 5.1.2 pEGFP-β-actin启动子表达质粒构建
• 5.1.3 pEGFP-β-actin启动子在293T细胞中的启动表达
• 5.2 GH基因与EGFP基因融合表达载体的构建及在真核细胞中表达
• 5.2.1 罗非鱼脑垂体组织总RNA的完整性及纯度鉴定
• 5.2.2 RT-PCR扩增结果
• 5.2.3 pEGFP-GH构建与鉴定
• 5.2.4 pEGFP-GH转染293T细胞及表达产物的检测与细胞内定位
• 5.2.5 RT-PCR检测GH基因RNA水平表达
• 6. 讨论
• 6.1 尼罗罗非鱼β-actin基因启动子功能验证结果讨论
• 6.2 GH基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在真核细胞中表达结果讨论
• 第三章 太湖鲢鱼mtDNA D-loop区遗传多样性
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 基因组DNA的提取
• 2.3 mtDNA D-loop区的PCR扩增
• 2.4 PCR产物纯化与目的片断的克隆及测序
• 2.5 数据处理
• 3. 结果
• 3.1 PCR扩增及阳性克隆鉴定
• 3.2 D-loop区序列多态性及核苷酸变异频率
• 3.3 单倍型系统发育树构建
• 4. 讨论
• 4.1 太湖鲢鱼mtDNA D-loop序列多态分析
• 4.2 太湖鲢鱼系统发育分析
• 全文结论
• 参考文献
• 附录:试验试剂及配置
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢