论文摘要
目的:1.观察辛伐他汀对K562细胞的增殖抑制和凋亡作用。2.观察辛伐他汀诱导K562细胞凋亡的线粒体通路相关物质变化。3.探讨K562细胞凋亡的线粒体通路调节机理。方法:1. MTT法检测辛伐他汀作用K562细胞后的增殖抑制率。2.光学显微镜观察凋亡细胞形态学改变。3.流式细胞仪测定细胞周期、细胞凋亡率、线粒体膜电位、细胞内游离Ca2+和ROS浓度变化。4.分光光度法检测辛伐他汀作用后K562细胞内Caspase-3,8,9酶活性、总NO及GSH水平。5. caspase-9与总NO抑制剂分别阻断caspase-9和总NO,以推测凋亡信号传导。6. RT-PCR检测凋亡相关基因D28K、iNOS、Bcl-2、Bax和Caspase-3,8,9。7.免疫组化法和Western blot技术检测cyto C蛋白。结果: 1. MTT结果显示:20μmol/L辛伐他汀作用于K562细胞12h、24h、48h和72h细胞增殖抑制率分别为0.00%,21.02%,58.33%,74.78%。2. 20μmol/L辛伐他汀作用K562细胞48h,细胞出现典型凋亡细胞形态学改变,包括核固缩、核碎裂和凋亡小体形成等。3. 20μmol/L辛伐他汀作用K562细胞12h、24h、48h和72h,细胞凋亡率变化分别为（2.55±0.26%）%, （6.1±0.35）%, （14.15±0.42）%, （30.70±0.65）%;24～72h期间,处理组与对照组的凋亡率比较差异具有统计学意义（P<0.05）。4.辛伐他汀作用K562细胞24～72h,G0/G1期细胞百分比增加,S期细胞百分比减少,细胞阻滞于G0/G1期。5. 24～72h期间,处理组K562细胞Caspase-3,8,9活性增加,48h活性最大,处理与对照组相比较差异具有统计学意义（P<0.05）;6. 24h时药物处理组细胞内总NO浓度开始升高,随作用时间增加细胞内总NO浓度增大,48～72h处理组与对照组比较具有统计学意义（P<0.05）。7.处理组细胞内GSH（谷光苷肽）在12～72h期间降至较低水平,与相应时间对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。8.荧光染料Fluo-3AM检测K562细胞内游离Ca2+浓度,处理组细胞Ca2+浓度均升高,峰值时间为12h,不同时间处理组与对照组相比Ca2+浓度显著升高（P<0.05）。9. 12h、24h、48h和72h处理组细胞MMP（线粒体膜电位）百分率降低分别为（0.7±0.24）%,（39.6±4.80）%, （24.4±2.45）%, （6.7±1.62）%,24～72h期间处理组的MMP与对照组相比较差异具有统计学意义（P<0.05）。10.荧光染料2′,7′-二氯荧光乙酰乙酸（2’,7’- dichloro fluorescein diacetate, DCFH-DA）检测处理组K562细胞内ROS（活性氧）浓度均升高,峰值时间为24h,与相应时间对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。11.处理组与加入caspase-9抑制剂的处理组之间比较,K562细胞凋亡率和数目无显著变化（P>0.05）。12.处理组与加入总NO抑制剂的处理组之间比较,NO抑制剂组的细胞数目无显著性变化（P>0.05）;细胞凋亡率显著降低（P<0.05）。13. 24～72h期间处理组的Apaf-1、D28K、iNOS、Bax和Caspase-3,8,9基因表达均不同程度上调;Bcl-2基因均不同程度下调;与对照组相比较差异具有统计学意义（P<0.05）。14. western blot和免疫组化检测结果显示:24～72h期间处理组细胞内cyto C蛋白均增加,与相应时间对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论: 1. 20μmol/L辛伐他汀能抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,其作用具有时间依赖性。2.辛伐他汀诱导K562细胞凋亡经过了线粒体通路。3.辛伐他汀诱导K562细胞凋亡除了线粒体通路外还有其它通路参与。4.参与辛伐他汀诱导562细胞凋亡的线粒体通路调节因素有:细胞内游离Ca2浓度的升高、细胞内氧化还原状态的失衡、NO浓度的升高、Bcl-2/Bax比值的降低。5.辛伐他汀诱导562细胞凋亡时经过线粒体通路是多因素调节的结果。